Summary
כאן אנו מתארים מערכת מיקרופיזיולוגית קלה ליישום, מתוקננת, המשקפת את המורכבות של מבנה ה-in vivo של מח העצם האנושי, ומספקת מודל רלוונטי לחקר עדין של מגוון רחב של אירועים נורמליים ופתולוגיים.
Abstract
הנישה המדולרית היא מערכת אקולוגית מורכבת החיונית לשמירה על הומאוסטזיס עבור תאים מקומיים. ואכן, מח העצם, הכולל מטריצה חוץ-תאית מורכבת וסוגי תאים שונים, כגון תאי גזע מזנכימליים, אוסטאובלסטים ותאי אנדותל, מעורב עמוקות בוויסות תאי גזע המטופויאטיים באמצעות אינטראקציות ישירות בין תאים לתאים, כמו גם ייצור ציטוקינים. כדי לחקות מקרוב את מבנה ה-in vivo הזה ולערוך ניסויים המשקפים את התגובות של מח העצם האנושי, נוצרו מספר מודלים תלת-ממדיים המבוססים על ביו-חומרים, המסתמכים בעיקר על תאים סטרומליים ראשוניים. כאן מתואר פרוטוקול לקבלת מערכת מינימלית וסטנדרטית שקל להקים אותה ומספקת תכונות של מבנה דמוי מח עצם, המשלב אוכלוסיות תאים שונות כולל תאי אנדותל, ומשקף את ההטרוגניות של רקמת מח עצם in vivo . מבנה דמוי מח עצם תלת-ממדי זה - המורכב באמצעות חלקיקים מבוססי סידן פוספט וקווי תאים אנושיים, המייצגים את המיקרו-סביבה של מח העצם - מאפשר ניטור של מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים על ידי שילוב או החלפה של אוכלוסיות תאים ראשוניים שונות בתוך המערכת. לאחר מכן ניתן לקצור את המבנים התלת-ממדיים הסופיים לצורך ניתוח תמונה לאחר קיבוע, הטמעת פרפין וצביעה היסטולוגית/אימונוהיסטוכימית לצורך לוקליזציה של תאים בתוך המערכת, או לנתק אותם כדי לאסוף כל רכיב תאי לצורך אפיון מולקולרי או פונקציונלי.
Introduction
מח עצם (BM) נמצא הן בחללים המרכזיים של עצמות ציריות וארוכות והן בעצמות שטוחות טרבקולריות, ומכיל מגוון מרכיבים תאיים ולא תאיים מובחנים. ברמה המבנית, הוא מורכב מאיי רקמה המטופויאטיים (הנקראים גם "המטונים")1,2 ותאי שומן המוקפים בסינוסים וסקולריים המשולבים בתוך עצם טרבקולרית3. בעצמות ארוכות ושטוחות, אספקת הדם לעצם ולמח העצם מחוברים ביניהם באמצעות רשת אנדוסטלית של כלי דם4. ה-BM, החבוי ברשת הגנה מוצקה זו, מארח תאים לא בשלים מאוד השקועים בסטרומה ספוגית ומהווה את המיקום להתמיינות של תאי גזע מזנכימליים מקומיים (MSCs) ותאי גזע המטופויאטיים (HSCs)5. ואכן, מלבד חידוש רקמות העצם באמצעות ייצור של osteoblasts, אחד הפונקציות הידועות העיקריות של BM שוכן בפיתוח hematopoiesis6.
הרקמה ההמטופוייטית של BM כוללת מגוון סוגי תאים, כלומר HSCs, מבשרים, ותאי דם ממוינים יותר כגון לימפוציטים, נויטרופילים, אריתרוציטים, גרנולוציטים, מונוציטים ותרומבוציטים7. תאים המטופויאטיים אינם מסודרים באופן אקראי במרחב ה-BM אלא מציגים ארגון מסוים בתוך הגומחות ההמטופוייטיות, הכוללות סוגי תאים רבים ממקורות שונים (אוסטאובלסטים, אוסטאוקלסטים, MSCs, אדיפוציטים, אנדותל סינוסואידלי ותאי סטרומל פריווסקולריים, תאי מערכת החיסון, תאי עצבים ותאים המטופויאטיים בוגרים מובהקים), ויוצרים מבנה מורכב כדי להבטיח המטופויאזיס תקין8 . הפונקציות הביולוגיות של הנישה ההמטופוייטית כוללות ויסות של הישרדות HSC, הידבקות, שקט, ביות והתמיינות באמצעות מנגנונים שונים (אינטראקציות תא-תא ומטריקס תא, ייצור גורמים מסיסים, היפוקסיה) בתגובה ללחצים פיזיולוגיים מרובים או לא פיזיולוגיים 3,6. אף על פי שנישות המטופויאטיות אלה נתפסו בתחילה כישויות הומוגניות, פיתוחים טכנולוגיים כגון ניתוחי תאים בודדים והדמיה חשפו בהדרגה את המורכבות, הדינמיקה ותכונות ההסתגלות שלהם 9,10,11.
הצורך המכריע בהחלפה ובצמצום השימוש בבעלי חיים לפענוח תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים אנושיים מוביל להזדמנויות ואתגרים חדשים11,12. בין הכלים החדשים שתוארו במבחנה, הוצעו מודלים תלת-ממדיים (3D) המחקים את ה-BM האנושי in vivo טוב יותר מאשר תרבויות דו-ממדיות קלאסיות (2D) 13,14,15,16,17. מודלים תלת-ממדיים נראים אפוא כגישה מבטיחה לצפייה באינטראקציות בין תא לתא ולמטריקס תאי, קרוב יותר לאלה המתרחשות in vivo. באמצעות מגוון מודלים אלה, כמה צוותים הדגימו את ההישרדות וההתפשטות של HSCs18,19. קיימים מספר מודלים תלת-ממדיים, כאשר הגישה הנפוצה ביותר היא שימוש בביו-חומרים תלת-ממדיים מבוססי פיגומים כגון הידרוג'לים, קולואידים או קולגן, הקשורים ל-MSCs המנצלים את יכולות ההתמיינות של השושלת האוסטאובלסטית שלהם20,21,22. עם זאת, לא הושגה הסכמה גלובלית למלא את כל הדרישות למחקרים על תאים אנושיים באופן ידידותי למשתמש וסטנדרטי23, במיוחד מכיוון שמערכות תלת-ממד נוכחיות אלה מסתמכות בעיקר על תאים סטרומליים ראשוניים, ולכן סובלות מגישה מוגבלת לדגימות ראשוניות, זמינות רקמות והטרוגניות.
בנוסף, יש להכניס את תא תאי האנדותל מכיוון שתאים אלה מייצגים מרכיב מרכזי באינטראקציות בין תאים ומעורבים בגורל תאי גזע ובהתפתחות מחלות BM, הן בלוקמיה24 והן בגרורות25. בעבר דיווחנו כי תוספת של אלמנטים פתולוגיים במודל מח עצם תלת-ממדי אנושי סטנדרטי משחזרת תכונות שנצפו בדגימות מטופלים כגון שינויים במטריצה חוץ-תאית (ECM)26. כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה והאינטראקציות בין המיקרו-סביבה האנושית של BM לבין התאים המקומיים, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מערכת ידידותית למשתמש וסטנדרטית לבניית מבנה מינימלי, מאורגן היטב, דמוי BM. מערכת זו מורכבת משלושה סוגי תאי מח עצם אנושיים - תאי אנדותל ותאים סטרומליים, המייצגים את המיקרו-סביבה, ותאי HSCs. על ידי שימוש בחרוזים ספציפיים כפיגום וכמדיום התמיינות אוסטאובלסטי, המבנה התלת-ממדי המתקבל יחקה את הנישה המדולרית האנושית, ויאפשר מחקר שימושי של מח עצם אנושי.
Protocol
הערה: כדי להכין את מבנה עמוד השדרה דמוי מח העצם, פרוטוקול זה מסתמך על שילוב חרוזים עם תאי אנדותל HMEC-1 ותאי סטרומה HS27A על חרוזי סידן פוספט דו-פאזיים (BCP). חרוזי ה-BCP ישמשו כפיגום המאפשר, עם מדיום מסוים, את העיצוב המבני התלת-ממדי.
1. הכנת חרוזים ועיקור
- שקלו 35-40 מ"ג של חרוזי BCP (HA/β-TCP 60/40; 45-75 מיקרומטר) עבור כל תוספת (צלחת פלסטיק קטנה, גלילית, עם קרום פוליקרבונט בתחתית) בצינור של 1.5 מ"ל (ראו טבלת חומרים). לאחר שקילת החרוזים, נשא חור קטן עם מחט נקייה דרך החלק העליון של צינור 1.5 מ"ל כדי למנוע את המכסה קופץ פתוח במהלך מחזור autoclave (121 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות), ומניחים את הצינורות במצב אנכי בתיבה סטרילית סגורה .
2.3D הכנס הכנה מתחת למכסה סטרילי
- שים תרבית תאי פוליקרבונט סטרילית מכניס בתוך בארות של צלחת 6 בארות. יוצקים חרוזי BCP סטריליים מצינור 1.5 מ"ל לתוך התוספת. שטפו את החרוזים בזהירות על ידי טפטוף של 350 μL של 1x מלח עם אגירת פוספט (PBS) בתוך התוסף ולאחר מכן הוסיפו 4.5 מ"ל של 1x PBS לבאר. הסר והשלך את ה- PBS באמצעות ואקום או פיפטה של 5 מ"ל על ידי הנחת הקצה בפינה של הבאר. חזור על שלב הכביסה פעמיים.
- לאחר שטיפת החרוזים, יש להשתמש ב-PBS אחד בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) כדי לחסום את המערכת. בזהירות להוסיף 350 μL של פתרון חוסם להוסיף 4.5 מ"ל לבאר ומניחים את כל הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לילה.
הערה: שלבים 2.1 ו-2.2 עוזרים למזער את שחרור היונים מחרוזי BCP לפני זריעת התאים.
3. קצירת קו תאים ותחזוקת תלת מימד
הערה: לאחר שלב דגירה זה, תאים מיקרו-סביבתיים מתווספים ליצירת עמוד השדרה של המבנה התלת-ממדי. מערכת זו מבוססת על שימוש ב- HMEC-1, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים המונצחים באנטיגן T גדול מ- SV40, ו- HS27A, תאי סטרומלים של מח עצם אנושיים המונצחים בנגיף הפפילומה האנושי, בשל יכולתם ליצור מבנה מוצק דמוי BM ותאימותם להכללת תאי אנדותל.
- לפני הוספת תאים למערכת, הכן את מדיית הדגירה הבאה:
- עבור 50 מ"ל של מדיום דיפרנציאציה אוסטאו מלא (ODM), יש לערבב 45 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) + 5 מ"ל של FBS + 0.5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין + 8 × 10-4 מ"ג/ליטר של דקסמתזון + 2.16 גרם/ליטר של בטא-גליצרופוספט + 44 מ"ג/ליטר של חומצה אסקורבית.
- עבור 50 מ"ל של מדיום HMEC-1 מלא, לערבב 45 מ"ל של MCDB 131 + 5 מ"ל של FBS + 0.5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין + 1% של תחליף גלוטמין + 1 מ"ג / ליטר של הידרוקורטיזון + 10 מיקרוגרם / ליטר של EGF.
- הסר את פתרון החסימה מהמערכת. ערבבו 1 × 10 6 תאי HMEC-1 (המייצגים את תא כלי הדם) ו-2 × 106 תאי HS27A (המייצגים את תא התא הסטרומלי המזנכימלי) בצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1,575 × גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט והוסיפו 175 מיקרו-ליטר של מדיום HMEC-1 (מדיום ספציפי לצמיחת תאי HMEC-1) עם 175 μL של ODM (מדיום ספציפי לאוסטאודיבנציה HS27A).
- יוצקים 350 μL של תרחיף זה המכיל 3 × 106 תאים סה"כ בתוך כל תוספת. לאחר מכן, לשפוך 4.5 מ"ל של המדיה המשולבת (2.25 מ"ל של HMEC-1 בינוני + 2.25 מ"ל של ODM) ללא תאים לתוך בארות של צלחת. בעדינות לשאוף ולפזר את התערובת מספר פעמים עם micropipette 1 מ"ל כדי homogenize את התאים ואת חרוזי BCP בתוך התוספת. הקצו את כל התערובת כדי להתיישב בתחתית התוספת.
הערה: מומלץ להשתמש בתכשיר תערובת עם נפח מת אחד אם מספר תוספות מתורבתות. לדוגמה, אם ארבע תוספות הן בתרבית, הכן תמיד את אמצעי האחסון הדרוש לחמש תוספות. - ברגע שתאי האנדותל והמזנכימליים הומוגניים בתוך התוספת, שמור את צלחת 6 הבאר בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 3 שבועות. שנה את המדיום בתוך התוסף ואת הבאר 2 פעמים בשבוע על ידי הסרה זהירה של המדיום מהתוסף באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל והנחת הקצה בקיר ההוספה הפנימי כדי למנוע הפרעה לפינת התוסף.
הערה: ניתן לאחסן את הסופרנטנט שנשלף בטמפרטורה של -80°C בכל שלב, לכימות חלבון מאוחר יותר.
4. הוספת תאים מעניינים למערכת
הערה: לאחר 3 שבועות של התרבות HMEC-1 ו-HS27A, האוסטאו-דיפרנציציה של תאי HS27A אפשרה את קשיחות המערכת. בשלב זה, הוסף תאים המטולוגיים בעלי עניין (מספר התאים שנוספו יכול להשתנות בין 1 × 104 ל- 1 × 106) בתוך התוספת. התאים שנוספו היו תאי TF1 שעברו טרנספקציה עם אונקוגן BCR-ABL ותאי CD34+ חד-גרעיניים ראשוניים שהגיעו מחולי לוקמיה מיאלואידית חריפה או מתורמים בריאים.
- שנה את הרכב המדיום בשלב זה, מכיוון שתרכובת ODM רעילה לתאים המטולוגיים ואין צורך להמשיך להוסיף אותה לאחר ביצוע קשיחות המערכת. לדוגמה, כדי לתמוך בתחזוקה המטופויאטית, החלף את מדיום ODM ב- RPMI מלא עבור קווי תאים המטופוייטיים (RPMI בתוספת 10% של FBS ו- 1% של פניצילין-סטרפטומיצין) או IMDM עבור תאים המטופויאטיים ראשוניים. הכינו אצווה של 50% מדיום HMEC-1 מלא ו-50% מדיום RPMI/IMDM מלא לשינויים התלת-ממדיים (פעמיים) בשבוע.
- השהה את התאים ההמטולוגיים המעניינים במדיום משולב זה והוסף אותו בתוך התוספת. אם נדרש פרוטוקול טיפול תרופתי, יש להמתין 24 שעות לאחר הוספת התאים המעניינים לפני הטיפול, ולתת להם זמן להיצמד למבנה דמוי העצם.
- התאימו את התקופה של תרבית תאים תלת-ממדית בהתאם לדרישות. רענן את המדיום (50% HMEC-1 מדיום שלם + 50% RPMI מדיום שלם) פעמיים בשבוע.
הערה: במהלך תרבית התאים התלת-ממדית, חלק מהתאים הדבקים עשויים לדלוף מחוץ לתוסף לתחתית הבארות, מה שמגדיל את הצריכה הבינונית. בדקו מתחת למיקרוסקופ אם יש פיזור תאים מעבר לתוסף והחליפו את התוסף בצלחת חדשה של 6 בארות מתחת למכסה סטרילי במידת הצורך.
5.3D תוצאות ניסוי דמוי מח עצם
הערה: בעקבות התרבות תלת-ממדית, ניתן להשיג מספר תוצאות בהתאם למטרות הניסוי.
- ניתוח חלבונים
הערה: במהלך הניסוי התלת-ממדי, ניתן לאסוף את החלבונים המופרשים על-ידי התאים הנמצאים במבנה דמוי מח העצם לצורך ניתוחים נוספים.- כאשר מדיום התרבית משתנה 2x בשבוע, אחסן את הסופרנאטנט שנשלף מתוך התוסף בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי להעריך את הייצור של חלבונים בעלי עניין בתוך המערכת.
- ניתוק תאים מהמבנה התלת-ממדי (מתחת למכסה מנוע סטרילי אם יש צורך למיין תאים)
הערה: ניתן לאחזר, למיין ולנתח את התאים שגודלו בתרבית במערכת דמוית מח עצם תלת-ממדית.- בסוף הניסוי, בצינור של 15 מ"ל, יש לערבב 4.5 מ"ל של RPMI עם 0.5 מ"ל של FBS בתוספת 0.4 מ"ג/מ"ל של קולגן, ולחמם את התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- מניחים את התוסף הפוך (צד הממברנה הלבן למעלה) על כיסוי סטרילי של 6 בארות כדי לחתוך את הממברנה החוצה כראוי. השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך את הממברנה מהצדדים, ובכך לשלוף דיסק מוצק לבן. הנח את הדיסק בתוך צינור 15 מ"ל חם מוכן בשלב 5.2.1.
- מניחים את הצינור בגלגל פעיל באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך 10 דקות כדי לאפשר עיכול (במגע עם קולגן). החל את אותו זמן דגירה עבור כל הממברנות כדי למנוע ניתוח מוטה.
- לאחר 10 דקות, צנטריפוגה של צינור 15 מ"ל למשך 5 דקות ב 1,575 × גרם בטמפרטורת החדר, להשליך את supernatant, ולהשהות את הכדור ב 5 מ"ל של PBS חם 1x. הערה: בשלב זה, מכיוון שממברנת הפוליקרבונט מרחפת בדרך כלל בשבר העל-טבעי, ניתן להשליך אותה באמצעות קצה פיפטה סטרילי. אם הממברנה עדיין כלולה בכדור, השאירו אותה והסירו אותה בסוף השלב הבא.
- לתלות את הכדור ב 300 μL של טריפסין חם, מערבל את הצינור במשך 10 שניות, ומניחים אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
- עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת 1 מ"ל של FBS טהור וחם. עם micropipette 1 מ"ל, מכנית לשאוף ולחלק את המדיום כדי לנתק לחלוטין את הדיסק.
זהירות: שלב השאיפה/חלוקה חייב להיות מהיר מאוד, אחרת החרוזים ישקעו בתוך הקצה. - צנטריפוגה את הצינור במשך 5 דקות ב 1,575 × גרם. יש להשעות את הכדור ב-3 מ"ל של PBS אחד בתוספת 10% FBS.
- השאירו את החרוזים למשקעים במשך 5 שניות לפני שאוספים את הסופרנטנט ומסננים אותו דרך מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר המונחת על צינור איסוף. צנטריפוגה את התסנין שנשלף במשך 5 דקות ב 1,575 × גרם. ספרו את התאים עם טריפן כחול כדי להעריך את הכדאיות והמשיכו לניתוחי ציטומטריה של זרימה.
הערה: מספר התאים בני הקיימא שנשלפו לאחר הדגירה הכחולה של טריפאן הוא ~1-2 × 105 תאים לכל תוספת מעוכלת.
- תיוג ציטומטריה של זרימה של תאים שאוחזרו
הערה: התאים שנשלפו מהמבנה דמוי מח העצם התלת-ממדי ניתנים לתיוג ולניתוח נוסף על-ידי ציטומטריה של זרימה. השתמש בתערובת של נוגדנים כדי לזהות את התאים השונים לאחר דיסוציאציה תלת-ממדית. כאן, CD45 (מכתים את התאים ההמטולוגיים המעניינים), CD31 (מכתים את תא כלי הדם) ו- CD73 (מכתים את התא האוסטאובלסטי) שימשו ב 1 μL ב 50 μL של PBS + 2% FBS. יש להרחיק את כל התאים והנוגדנים המוכנים על קרח (4 מעלות צלזיוס) מאור במהלך כל התהליך.- יש לתלות את הכדורים בתערובת הנוגדנים ולדגור במשך 30-40 דקות על קרח, הרחק מהאור.
- הוסף 1 מ"ל של PBS + 2% FBS כדי לשטוף את התאים ואת הצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,575 × גרם.
- השהה את הכדור המאוחזר ב-200 μL של 1x PBS + 10% FBS בתוספת 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI, מדולל 1:2,000).
- לנתח את הצינורות בציטומטר באמצעות הפרמטרים הבאים: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. השתמש בתרשים FSC-H לעומת FSC-W כדי לשער את אוכלוסיית הסינגלט. בחלק הסינגלט, השתמש בתרשים DAPI-A לעומת FSC-A כדי לקבוע את אוכלוסיית התאים בני הקיימא (DAPI-שלילי). כאשר האוכלוסייה השלילית של DAPI הייתה מגודרת בעבר, השתמש בתרשים APC-A לעומת FSC-A כדי לקבוע את האוכלוסייה החיובית ל-CD45.
- קיבוע של המבנה דמוי מח העצם התלת-ממדי
הערה: קיבוע של המבנה דמוי BM התלת-ממדי מבוצע בדרך כלל עבור אימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנציה כדי לדמיין תאים באתרם ולהכתים ספציפיים נוספים.- כדי לתקן את המבנה דמוי BM, העבר את התוספת (שלב 4.3) מהצלחת הישנה לצלחת חדשה בת 6 בארות מלאה ב- PBS 1x. לאחר מכן, החלף בעדינות את המדיום בתוך התוסף ב- PBS אחד.
הערה: אין לשטוף את המבנה שנוצר עם PBS; הלחץ של הנוזל עלול לפגוע במבנה התלת-ממדי. - לאחר שטיפת התוספת, הניחו אותה בתוך צלחת חדשה של 6 בארות ומלאו גם את הבאר וגם את התוסף בפרפורמלדהיד (PFA) שנפתח זה עתה ב-4% (מדולל ב-1x PBS).
- אפשרו לתהליך הקיבוע להתקדם במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר הרחק מאור.
- בסוף תהליך הקיבוע, יש לשטוף את התוסף פעם אחת עם PBS אחד ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס הרחק מאור.
- חתוך את הממברנה בתחתית התוסף כמתואר בשלב 5.2.2 כדי לאחזר את הדיסק המוצק.
- דגירה של הדיסק 4x במשך 48 שעות ב- EDTA (0.5 M, pH 8) על מנת לפרק את המבנה.
- מטמיעים את המבנה בפרפין ופורסים חלקים בעובי 4 מיקרומטר.
- באמצעות חיסון אוטומטי, דגרו את החלקים עם נוגדנים נגד CD45, אנטי-CD73 ו-Ki67. דמיינו את הכתמים עם סוס נגד ארנב או עכבר צנון פרוקסידאז (HRP) ועם 3,3'-דיאמינובנזידין כמצע כרומוגני וכתם נגדי עם המטוקסילין של גיל.
- כדי לתקן את המבנה דמוי BM, העבר את התוספת (שלב 4.3) מהצלחת הישנה לצלחת חדשה בת 6 בארות מלאה ב- PBS 1x. לאחר מכן, החלף בעדינות את המדיום בתוך התוסף ב- PBS אחד.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לשחזר מיקרו-סביבה אנושית זעירה, במבחנה , תלת-ממדית, דמוית BM, שממנה ניתן לשלוף תאים בני קיימא משלושה תאי תאים שונים (איור 1). ואכן, לאחר החשיפה הרצויה, מבנים דמויי BM תלת-ממדיים יכולים להיות מנותקים, וניתן להעריך/לאפיין את תאי ה-MSCs, תאי האנדותל והתאים ההמטופוייטיים באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2A). עד כה, התוצאות מצביעות על כך שניתן לשמור על תאים המטולוגיים במשך 6 שבועות לפחות בתוך המודל התלת-ממדי, לפני שליפת תאים בני קיימא (איור 2B). עם זאת, חקירות עתידיות נדרשות כדי להעריך את הגבול של מודל תלת-ממדי זה. בנוסף, במידת הצורך, ניתן להחליף את קו התאים HS27A ב-MSC ראשוני של מח עצם תקין (NBM) או בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) MSC במודל תלת-ממדי זה דמוי BM (איור 2C) או להחליף את קו התאים ההמטופוייטיים ב-HSCs ראשוניים (איור 2D). יתר על כן, בעת ניתוח האינטראקציות בין תאי התא או לוקליזציה של סמנים ספציפיים של עניין, מבנים דמויי BM 3D ניתן לתקן ולעבד עוד יותר עם הטמעת פרפין ואימונוכימיה. לדוגמה, הניתוח של תוכן CD45 (המטולוגי) או CD73 (MSC) בוצע באמצעות מודלים תלת-ממדיים אלה (איור 3).
איור 1: דיאגרמה סכמטית של ההגדרה הראשונית של מערכת דמוית BM תלת-ממדית אנושית. לאחר 3 שבועות של תרבית משותפת, רקמה מוצקה דמוית BM ניתן לאסוף או לזרוע עם תאים hematopoietic (כמו בדוגמה) או סוגי תאים אחרים. במידת הצורך, ברגע שהתאים נדבקים, ניתן להוסיף טיפול ולבצע שינויים בינוניים פעמיים בשבוע. בסוף הניסוי, מבנים דמויי BM יכולים להיות קבועים ומעובדים עוד יותר למחקרי לוקליזציה או לנתק אותם כדי להעריך את תכולת התא. קיצורים: BCP = סידן פוספט דו-פאזי; BM = מח עצם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: התאוששות של תאים בני קיימא ממדורים שונים לאחר תרבית במודל תלת-ממדי דמוי BM. (A) דפוס אופייני של התאוששות תאים ממבנה אחד דמוי BM מנותק עם 9.84% של תאים בני קיימא (DAPI-). חלקות מייצגות של תאים המטופויאטיים (66.6% CD45+), תאי MSC/אוסטאובלסט (88.6% תאי CD73+ באוכלוסיית CD45) ותאי אנדותל (22.1% תאי CD31+ באוכלוסיית CD45) התאוששו לאחר דיסוציאציה תלת-ממדית. (B) המערכת התלת-ממדית מאפשרת תחזוקה של תאים המטופויאטיים בני קיימא (CD45+) עד 6 שבועות לאחר התרבית. (C) מערכות תלת-ממד העשויות מ-MSCs ראשוניים מ-NBM או AML לצד HMEC-1 (צבועות בקוסבירה-כתום בדוגמה זו) יכולות לשמור על HSCs (3.88% CD45+ DAPI- תאים) באתרם (D). קיצורים: BM = מח עצם; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; MSC = תא גזע מזנכימלי; NBM = מח עצם רגיל; AML = לוקמיה מיאלואידית חריפה; HSCs = תאי גזע המטופויאטיים; FSC = פיזור קדימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הדמיה של אינטראקציות בין תאים ושגשוג בתוך המודל התלת-ממדי דמוי BM. המערכות נאספו לאחר 3 שבועות של תרבית תלת-ממדית משותפת עם HS27A ו-HMEC-1 ותוספת של תאים המטופויאטיים לאחר שבוע. צביעת אימונוהיסטוכימיה טיפוסית (דמיונית בצבע חום) על ידי IHC הודגמה באמצעות פרוקסידאז נגד ארנב או סוס עכבר והודמיינה עם 3,3′-diaminobenzidine כמצע כרומוגני ומוכתמת ב-Gill's-hematoxylin ומראה נוכחות של תאים המטופויאטיים עם CD45 (פאנל שמאלי), תאים סטרומליים עם CD73 (פאנל אמצעי), או התפשטות של כל התאים עם KI67 (פאנל ימני). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: BM = מח עצם; IHC = אימונוהיסטוכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
אחד האתגרים הנוכחיים העומדים בפני מחקרים על סוגיות פיזיולוגיות אנושיות ופתולוגיות נלוות הוא היעדר מודלים המחקים במדויק את התפקודים המורכבים של איברים אנושיים. במקרה של מודלים תלת-ממדיים אנושיים של BM, מודלים רבים משתמשים בהידרוג'לים ומשחזרים חלקית את ה-BM, מה שממחיש את כוחם של תנאי התרבות התלת-ממדית בהשוואה לתרבויות דו-ממדיות קלאסיות כדי להבטיח, למשל, הבחנה אוסטאובלסטית טובה יותרשל 27,28. עם זאת, למרות יכולת שכפול טובה וקלות שימוש, מערכות אלה אינן מחקות את המבנה והארכיטקטורה התלת-ממדיים של BM האנושי, מה שעשוי להשפיע באופן משמעותי על ניתוחים נוספים. ההתקדמות הטכנולוגית אפשרה למדענים לשחזר טוב יותר את סביבת הנישה האוסטאובלסטית האנושית באמצעות מערכת ביו-ריאקטור מבוססת זלוף כדי לשמור על כמה תכונות HSC29. פיתוח התקנים מיקרופלואידיים הוביל לגישות חדשות לשחזור מבנה רלוונטי דמוי מח עצם, אך עד כה השיגו רק תכונות מוגבלות של מח העצם, ולכן הגבילו את היישומים30,31,32,33.
ההתקדמות במדעי החומרים תרמה לפיתוח מגוון רחב של ביו-חומרים טבעיים או סינתטיים, שניתן להשתמש בהם לפיתוח מערכות רלוונטיות של תרביות עצם תלת-ממדיות. עם זאת, לעתים קשה לפתח מערכות כאלה במעבדות ביולוגיות סטנדרטיות ללא כישורים פנימיים בביופיזיקה. יתר על כן, ברוב המקרים, מערכות אלה משיגות יכולת מוגבלת לחקות את המבנה התלת-ממדי של העצם האנושית, כולל המיקרו-סביבה BM, והשתמשו בכמויות גדולות של ציטוקינים וגורמי גדילה, תוך יצירת מדיום תרבותי עשיר באופן מלאכותי34.
הבחירה לגרום לדיפרנציאציה אוסטאובלסטית ולא להבחנה אדיפוציטית התבססה על העובדה שפרואוסטאובלסטים ואוסטאובלסטים תוארו כחלק מהגומחה האנדוסטלית35. זה זיהה תאים אוסטאובלסטיים כמרכיבים מבוקשים של עצם ומח עצם. בין המרכיבים הסלולריים של מוח העצם, תאי אנדותל וסטרומל תופסים חלק גדול מהמיקרו-סביבה. בנוסף, שני סוגי תאים אלה מייצרים רכיבים לא-תאיים מבניים של המטריצה החוץ-תאית וציטוקינים המעורבים בוויסות ההומאוסטזיס וההתמיינות, המתבקשים כאן כדי ליצור מבנה סידן. לפיכך, זה מצדיק את השימוש בתאי אנדותל וסטרומל, ואת הבחירה שלנו בקווי תאים כדי לאפשר גישה נוחה ולהגביר את יכולת ההתרבות בין המעבדות. כאשר התרבית של קו HMEC-1 הייתה יציבה יותר לאורך זמן, קו תאים זה נשמר לפיתוח מערכת התלת-ממד. עבור תאים סטרומלים, השווינו בתרבית דו-ממדית את יכולת ההתמיינות של אוסטאובלסטים של קווי התאים הסטרומליים שמקורם במח עצם רגיל: HS5 ו-HS27A. מצאנו שקו HS5 לא הבדיל באותה מידה כמו קו HS27A במערכת התלת-ממדית שנוצר עם אף אחד מקווי התאים. בהקשר זה, ניסיונות להחליף תאי HS27A בקו HS5 הביאו לייצור מבנה פחות נוקשה, מה שמרמז על כך ש-HS27A מתאימים יותר.
קווי התאים HS27A ו-HMEC-1 גודלו בתרבית בשילובי מדיה שונים, שבהם ניתן להשיג את המבנה הנוקשה ביותר ואת היישורים של HMEC-1 לאורך מבנים אוסטאובלסטיים, כך שהייצור של המטריצה החוץ-תאית מביא קשיחות יחסית למבנה הבסיסי. ניתוח התקדמות ההתמיינות ב- D14 הראה כי ההתמיינות הייתה מתקדמת יותר ב- D21 (מדידה של BSP, סמן אוסטאובלסטי מאוחר), עם יחס של 1:2 עבור HMEC-1:HS27A ועם תוצאות טובות יותר כאשר הוצגו 2 × 106 HS27A. לתאי אנדותל יש גם תפקיד חשוב בוויסות הומאוסטזיס והתמיינות (בין היתר באמצעות אספקת ציטוקינים). העובדה שתאי HMEC-1 נשמרים במערכת זו מצביעה על כך שהם יכולים לפחות למלא את התפקיד הזה, וזה תורם ללגיטימיות של המודל שלנו. עבור קו האנדותל HMEC-1, היה חשוב להציג אותו מוקדם מספיק כדי שניתן יהיה לשלב אותו כראוי במבנה ובתקווה שתאים אלה יוכלו ליצור יישורים או אפילו צינורות בתוך המבנה. בדיקות תרבות משותפת של HS27A ו- HMEC-1 בוצעו על ידי הצגת האחרון בשלבים שונים: D0, D7, D14; לא נצפה הבדל בולט, לא בהתמיינות של התאים הסטרומליים ולא בתחזוקה או במיקום של תאי האנדותל. לפיכך, תאים אלה הוכנסו בתחילת התהליך. תאים המטופויאטיים הוכנסו בתקופה שבה התמיינות אוסטאובלסטית תהיה מתקדמת מספיק כדי להעדיף אינטראקציות בין תאים. בחירה זו הותנתה גם על ידי העובדה כי הבחנה אוסטאובלסטית זו מותנית על ידי שימוש במדיום, אשר על פי הבדיקות שלנו, אינו תומך באופן מלא בשמירה על התאים hematopoietic. תאים המטולוגיים יכולים להיות קווי תאים או תאים המטופויאטיים ראשוניים מסוג BM CD45.
מהמודל התלת-ממדי הזה יכולנו לחזות החלפה של כל סוג תא בתאים ראשוניים, רגילים או פתולוגיים, או אפילו להוסיף סוגי תאים אחרים כדי להגביר את התכונות הביומימטיות, כגון תאי מערכת החיסון, אדיפוציטים או פיברובלסטים26. למעשה, קו התאים HS27A הוחלף ב-MSCs ראשוניים של BM עם מעבר נמוך. באופן דומה, קווי תאים המטולוגיים הוחלפו בתאים המטופויאטיים ראשוניים של BM. עם זאת, החלפת תאי HMEC-1 בתאי אנדותל ראשוניים עדיין לא נבדקה. נכון לעכשיו, מודל זה עדיין יכול להשתפר במונחים של ייצוג כלי הדם, שכן למרות שתאי אנדותל נמצאים ומתקשרים בצורה נכונה עם תאים אחרים מהמיקרו-סביבה (למשל, תאים המטופויאטיים), הם אינם יוצרים כלי דם מובנים, ובכך מונעים זליגת זרימה כדי לחקות כלי דם מתפקדים. בסך הכל, זה יכול להגדיל בהדרגה את המורכבות והייצוגיות של המודל התלת-ממדי המינימלי הנוכחי. תוספת של סוגי תאים אחרים עשויה להקל על מחקרים החוקרים נושאים אחרים, כגון החשיבות של דלקת BM מקומית או עמידות לאימונותרפיה.
עם זאת, מערכת 3D זו זקוקה ל -3 שבועות לפני שניתן יהיה להוסיף תאים מעניינים, תאים המטולוגיים או תאי סרטן אפיתל אם תהליך גרורות מוערך. יש לשמור על תנאים סטריליים, שכן שינויים בינוניים פעמיים בשבוע יכולים לפעמים להוביל לזיהום בינוני. יתר על כן, מכיוון שחלק מהתאים עשויים לנדוד דרך הנקבוביות של התוסף ולהתחיל להתפזר לתוך הבאר, מה שמוביל לצריכה בינונית מוגברת, מומלץ ניטור קבוע.
תיארנו כאן פיגום תלת-ממדי המאפשר התמיינות אוסטאובלסטית ופיתחנו מיקרו-סביבה אנושית רלוונטית, במבחנה , תלת-ממדית, דמוית BM. מערכת זו מאפשרת ניתוח in situ ושליפת תאים חיים אולטימטיבית. מערכת זו מספקת כלי חדש וגמיש ביותר, ניתן לשחזור וידידותי למשתמש, עם מגוון רחב של יישומים לחקר אינטראקציות ומנגנונים בתוך המיקרו-סביבה האנושית של BM.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לפ' בטיסטון-מונטן וא' ג'מבון מפלטפורמת הציטומטריה של CRCL ול-נ' גדות וג' לנב מפלטפורמת הפתולוגיה המחקרית, המחלקה למחקר תרגומי וחדשנות, מרכז לאון ברארד. המחברים מודים ל- B. Manship על המהדורה האנגלית. עבודה זו מומנה על ידי Inserm ו- FI-LMC ל- V. M. S., ו- S. L. K. A. ו- L. B. נתמכו על ידי מענק מ- Société Française d'Hématologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
- Janel, A., et al. Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche. American Journal of Hematology. 92 (10), 1020-1031 (2017).
- Blazsek, I., et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. Experimental Hematology. 23 (4), 309-319 (1995).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Kopp, H. -G., Avecilla, S. T., Hooper, A. T., Rafii, S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology. 20 (5), 349-356 (2005).
- Hawley, R. G., Ramezani, A., Hawley, T. S. Hematopoietic stem cells. Methods in Enzymology. 419, 149-179 (2006).
- Gulati, G. L., Ashton, J. K., Hyun, B. H. Structure and function of the bone marrow and hematopoiesis. Hematology/Oncology Clinics of North America. 2 (4), 495-511 (1988).
- Dean, L. Blood and the Cells it Contains. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ (2005).
- Kandarakov, O., Belyavsky, A., Semenova, E. Bone marrow niches of hematopoietic stem and progenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4462 (2022).
- Batsivari, A., et al. Dynamic responses of the haematopoietic stem cell niche to diverse stresses. Nature Cell Biology. 22 (1), 7-17 (2020).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Tjin, G., et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies. Bone. 119, 19-35 (2019).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (5), 345-361 (2021).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Walasek, M. A., van Os, R., de Haan, G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Annals of the New York Academy of Sciences. 1266 (1), 138-150 (2012).
- Discher, D., et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Annals of Biomedical Engineering. 37 (5), 847-859 (2009).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Gamblin, A. L., et al. Osteoblastic and osteoclastic differentiation of human mesenchymal stem cells and monocytes in a miniaturized three-dimensional culture with mineral granules. Acta Biomaterialia. 10 (12), 5139-5147 (2014).
- Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
- Taqvi, S., Roy, K. Influence of scaffold physical properties and stromal cell coculture on hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6024-6031 (2006).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Kotha, S. S., et al. Engineering a multicellular vascular niche to model hematopoietic cell trafficking. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 77 (2018).
- Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (6), 1256-1261 (2018).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, J. H. D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 28-35 (2005).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Kusumbe, A. P. Vascular niches for disseminated tumour cells in bone. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 112-116 (2016).
- Voeltzel, T., et al. A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes. Biomaterials Science. 10 (2), 485-498 (2022).
- Costantini, M., et al. 3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitro neocartilage formation. Biofabrication. 8 (3), 035002 (2016).
- Chatterjee, K., et al. The effect of 3d hydrogel scaffold modulus on osteoblast differentiation and mineralization revealed by combinatorial screening. Biomaterials. 31 (19), 5051-5062 (2010).
- Bourgine, P. E., et al. In vitro biomimetic engineering of a human hematopoietic niche with functional properties. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (25), 5688-5695 (2018).
- Carvalho, M. R., Reis, R. L., Oliveira, J. M. Mimicking the 3D biology of osteochondral tissue with microfluidic-based solutions: breakthroughs towards boosting drug testing and discovery. Drug Discovery Today. 23 (3), 711-718 (2018).
- de al Puente, P., et al. 3D tissue-engineered bone marrow as a novel model to study pathophysiology and drug resistance in multiple myeloma. Biomaterials. 73, 70-84 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Mansoorifar, A., Gordon, R., Bergan, R., Bertassoni, L. E. Bone-on-a-chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue. Advanced Functional Materials. 31 (6), 2006796 (2021).
- Nelson, M. R., et al. A multi-niche microvascularized human bone marrow (hBM) on-a-chip elucidates key roles of the endosteal niche in hBM physiology. Biomaterials. 270, 120683 (2021).
- Galán-Díez, M., Kousteni, S. The osteoblastic niche in hematopoiesis and hematological myeloid malignancies. Current Molecular Biology Reports. 3 (2), 53-62 (2017).
