Summary
Aquí, describimos un sistema microfisiológico estandarizado y fácil de implementar que refleja la complejidad de la estructura in vivo de la médula ósea humana, proporcionando un modelo pertinente para estudiar finamente una amplia gama de eventos normales y patológicos.
Abstract
El nicho medular es un ecosistema complejo que es esencial para mantener la homeostasis de las células residentes. De hecho, la médula ósea, que incluye una matriz extracelular compleja y varios tipos de células, como células madre mesenquimales, osteoblastos y células endoteliales, está profundamente involucrada en la regulación de las células madre hematopoyéticas a través de interacciones directas célula-célula, así como en la producción de citoquinas. Para imitar de cerca esta estructura in vivo y realizar experimentos que reflejen las respuestas de la médula ósea humana, se han creado varios modelos 3D basados en biomateriales, basándose principalmente en células estromales primarias. Aquí, se describe un protocolo para obtener un sistema mínimo y estandarizado que es fácil de configurar y proporciona características de estructura similar a la médula ósea, que combina diferentes poblaciones celulares, incluidas las células endoteliales, y refleja la heterogeneidad del tejido de médula ósea in vivo . Esta estructura 3D similar a la médula ósea, ensamblada con partículas a base de fosfato de calcio y líneas celulares humanas, representativas del microambiente de la médula ósea, permite el monitoreo de una amplia variedad de procesos biológicos mediante la combinación o reemplazo de diferentes poblaciones celulares primarias dentro del sistema. Las estructuras 3D finales pueden ser recolectadas para el análisis de imágenes después de la fijación, la incrustación de parafina y la tinción histológica/inmunohistoquímica para la localización celular dentro del sistema, o disociadas para recolectar cada componente celular para la caracterización molecular o funcional.
Introduction
La médula ósea (BM) se encuentra dentro de las cavidades centrales de los huesos axiales y largos y los huesos planos trabeculares, y contiene una variedad de componentes celulares y no celulares distintos. A nivel estructural, consiste en islas de tejido hematopoyético (también llamadas "hematones")1,2 y células adiposas rodeadas de senos vasculares intercalados dentro del hueso trabecular3. En los huesos largos y planos, el suministro de sangre al hueso y la médula ósea están interconectados a través de una red endosteal de vasos4. Oculto en esta sólida red protectora, el BM alberga células muy inmaduras inmersas en un estroma esponjoso y constituye el lugar para la diferenciación de células madre mesenquimales residentes (MSC) y células madre hematopoyéticas (HSCs)5. De hecho, además de la renovación de los tejidos óseos a través de la producción de osteoblastos, una de las principales funciones conocidas del BM reside en el desarrollo de la hematopoyesis6.
El tejido hematopoyético BM incluye una variedad de tipos de células, a saber, HSC, precursores y células sanguíneas más diferenciadas como linfocitos, neutrófilos, eritrocitos, granulocitos, monocitos y trombocitos7. Las células hematopoyéticas no están dispuestas aleatoriamente en el espacio BM, sino que muestran una organización particular dentro de los nichos hematopoyéticos, que incluyen muchos tipos de células de diferentes orígenes (osteoblastos, osteoclastos, MSC, adipocitos, endotelio sinusoidal y células del estroma perivascular, células inmunes, células nerviosas y distintas células hematopoyéticas maduras), formando una estructura compleja para asegurar la hematopoyesis normal8 . Las funciones biológicas del nicho hematopoyético incluyen la regulación de la supervivencia de HSC, adhesión, quiescencia, homing y diferenciación a través de diferentes mecanismos (interacciones célula-célula y célula-matriz, producción de factores solubles, hipoxia) en respuesta a múltiples tensiones fisiológicas o no fisiológicas 3,6. Aunque estos nichos hematopoyéticos fueron percibidos inicialmente como entidades homogéneas, los avances tecnológicos como los análisis unicelulares y de imagen han revelado progresivamente su complejidad, dinámica y propiedades adaptativas 9,10,11.
La necesidad crucial de reemplazar y reducir el uso de animales para descifrar los procesos fisiológicos y patológicos humanos conduce a nuevas oportunidades y desafíos11,12. Entre las herramientas in vitro recientemente descritas, se han propuesto modelos tridimensionales (3D) que imitan el BM humano in vivo mejor que los cultivos bidimensionales clásicos (2D) 13,14,15,16,17. Por lo tanto, el modelado 3D parece ser un enfoque prometedor para observar las interacciones célula-célula y célula-matriz, más cercanas a las que ocurren in vivo. Utilizando una variedad de estos modelos, algunos equipos han demostrado la supervivencia y proliferación de HSCs18,19. Existen varios modelos 3D, siendo el enfoque más común el uso de biomateriales 3D basados en andamios como hidrogeles, coloides o colágenos, asociados a MSCs aprovechando sus capacidades de diferenciación de linaje osteoblástico20,21,22. Sin embargo, no se ha alcanzado un consentimiento global para cumplir con todos los requisitos para estudios en células humanas de una manera fácil de usar y estandarizada23, especialmente porque estos sistemas 3D actuales dependen principalmente de células estromales primarias y, por lo tanto, sufren de acceso limitado a muestras primarias, disponibilidad de tejidos y heterogeneidad.
Además, se debe introducir el compartimento de células endoteliales, ya que estas células representan un componente importante de las interacciones célula-célula y están involucradas en el destino de las células madre y el desarrollo de la enfermedad BM, tanto en la leucemia24 como en la metástasis25. Anteriormente informamos que la adición de elementos patológicos en un modelo estandarizado de médula ósea 3D humana recapitula características observadas en muestras de pacientes, como alteraciones de la matriz extracelular (MEC)26. Para comprender mejor la dinámica y las interacciones entre el microambiente humano de BM y las células residentes, proporcionamos un protocolo detallado para un sistema estandarizado y fácil de usar para construir una estructura mínima, bien organizada y similar a BM. Este sistema está compuesto por tres tipos de células de médula ósea humana: células endoteliales y células del estroma, que representan el microambiente, y HSC. Mediante el uso de cuentas específicas como andamio y medio de diferenciación osteoblástica, la estructura 3D obtenida imitará el nicho medular humano, permitiendo un estudio práctico de la médula ósea humana.
Protocol
NOTA: Para preparar la estructura de la columna vertebral similar a la médula ósea, este protocolo se basa en la combinación de perlas con células endoteliales HMEC-1 y células estromales HS27A en perlas bifásicas de fosfato de calcio (BCP). Las perlas BCP servirán como un andamio que permite, con un medio específico, la conformación estructural 3D.
1. Preparación y esterilización de cuentas
- Pesar 35-40 mg de perlas de BCP (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) por cada inserto (plato pequeño, cilíndrico, de plástico con una membrana de policarbonato en la parte inferior) en un tubo de 1,5 ml (ver Tabla de materiales). Después de pesar las perlas, perfore un pequeño orificio con una aguja limpia a través de la parte superior del tubo de 1,5 ml para evitar que la tapa se abra durante el ciclo de autoclave (121 °C durante 60 min), y coloque los tubos en posición vertical en una caja estéril cerrada.
2.3D Inserte la preparación debajo de una campana estéril
- Coloque insertos de cultivo celular de policarbonato estéril dentro de los pocillos de una placa de 6 pocillos. Vierta las perlas BCP estériles de un tubo de 1,5 ml en el inserto. Lave las perlas cuidadosamente goteando 350 μL de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) dentro del inserto y luego agregue 4.5 ml de 1x PBS al pozo. Retire y deseche el PBS usando vacío o una pipeta de 5 ml colocando la punta en una esquina del pozo. Repita el paso de lavado dos veces.
- Una vez que se laven las perlas, use 1x PBS suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) para bloquear el sistema. Agregue cuidadosamente 350 μL de la solución de bloqueo al inserto y 4,5 ml al pocillo y coloque toda la placa en una incubadora a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
NOTA: Los pasos 2.1 y 2.2 ayudan a minimizar la liberación de iones de las perlas BCP antes de la siembra celular.
3. Recolección de líneas celulares y mantenimiento 3D
NOTA: Después de este paso de incubación, se agregan células microambientales para formar la columna vertebral de la estructura 3D. Este sistema se basa en el uso de HMEC-1, células endoteliales microvasculares humanas inmortalizadas con el antígeno T grande de SV40, y HS27A, células estromales de médula ósea humana inmortalizadas con el virus del papiloma humano, debido a su capacidad para formar una estructura sólida similar a BM y a su compatibilidad con la inclusión de células endoteliales.
- Antes de agregar celdas al sistema, prepare los siguientes medios de incubación:
- Para 50 ml de medio de osteodiferenciación (ODM) completo, mezcle 45 ml de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) + 5 ml de FBS + 0,5 ml de penicilina-estreptomicina + 8 × 10-4 mg/L de dexametasona + 2,16 g/L de beta-glicerofosfato + 44 mg/L de ácido ascórbico.
- Para 50 ml de medio HMEC-1 completo, mezclar 45 ml de MCDB 131 + 5 ml de FBS + 0,5 ml de penicilina-estreptomicina + 1% de sustituto de glutamina + 1 mg/L de hidrocortisona + 10 μg/L de EGF.
- Elimine la solución de bloqueo del sistema. Mezclar 1 × 10 6 células HMEC-1 (que representan el compartimento vascular) y 2 × 106 células HS27A (que representan el compartimento de células estromales mesenquimales) en un tubo de 15 ml y centrifugar durante 5 min a 1.575 × g a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y añadir 175 μL de medio HMEC-1 (medio específico para el crecimiento celular HMEC-1) con 175 μL de ODM (medio específico para osteodiferenciación HS27A).
- Vierta 350 μL de esta suspensión que contiene 3 × 106 celdas totales dentro de cada inserto. Luego, vierta 4.5 ml de los medios combinados (2.25 ml de medio HMEC-1 + 2.25 ml de ODM) sin células en los pocillos de la placa. Aspire suavemente y dispense la mezcla varias veces con una micropipeta de 1 ml para homogeneizar las células y las perlas BCP dentro del inserto. Asigne toda la mezcla para que se asiente en la parte inferior del inserto.
NOTA: Se recomienda una preparación de mezcla con un volumen muerto si se cultivan varios insertos. Por ejemplo, si se cultivan cuatro insertos, siempre prepare el volumen requerido para cinco insertos. - Una vez que las células endoteliales y mesenquimales estén homogeneizadas dentro del inserto, mantenga la placa de 6 pocillos dentro de una incubadora a 37 ° C, 5% deCO2 durante 3 semanas. Cambie el medio dentro del inserto y el pozo 2 veces a la semana retirando cuidadosamente el medio del inserto con una micropipeta de 1 ml y colocando la punta en la pared interior del inserto para evitar perturbar la esquina del inserto.
NOTA: El sobrenadante recuperado puede almacenarse a -80 °C en cualquier paso para su posterior cuantificación de proteínas.
4. Adición de celdas de interés en el sistema
NOTA: Después de 3 semanas de cultivo de HMEC-1 y HS27A, la osteodiferenciación de las células HS27A permitió la rigidificación del sistema. En este paso, agregue células hematológicas de interés (el número de células agregadas puede variar de 1 × 104 a 1 × 106) dentro del inserto. Las células añadidas fueron células TF1 transfectadas con oncogén BCR-ABL y células CD34+ mononucleadas primarias procedentes de pacientes con leucemia mieloide aguda o de donantes sanos.
- Cambie la composición del medio en este paso, ya que el compuesto ODM es tóxico para las células hematológicas y no hay necesidad de continuar añadiéndolo una vez que se realiza la rigidificación del sistema. Por ejemplo, para apoyar el mantenimiento hematopoyético, sustituya el medio ODM con RPMI completo por líneas celulares hematopoyéticas (RPMI suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina) o IMDM para células hematopoyéticas primarias. Prepare un lote de medio HMEC-1 completo al 50% y RPMI/IMDM completo al 50% para los cambios semanales del medio 3D (dos veces).
- Resuspender las células hematológicas de interés en este medio combinado y añadirlo dentro del inserto. Si se requiere un protocolo de tratamiento farmacológico, espere 24 h después de agregar las células de interés antes de tratar, dándoles tiempo para adherirse a la estructura similar al hueso.
- Adaptar el período de cultivo celular 3D según los requisitos. Actualice el medio (50% HMEC-1 medio completo + 50% RPMI medio completo) dos veces por semana.
NOTA: En el transcurso del cultivo celular 3D, algunas células adherentes pueden filtrarse fuera del inserto en el fondo de los pocillos, aumentando el consumo medio. Verifique bajo el microscopio la dispersión celular más allá del inserto y reemplace el inserto en una nueva placa de 6 pocillos debajo de una campana estéril si es necesario.
5.3D resultados experimentales similares a la médula ósea
NOTA: Después del cultivo 3D, se pueden lograr varios resultados de acuerdo con los objetivos del experimento.
- Análisis de proteínas
NOTA: En el transcurso del experimento 3D, las proteínas secretadas por las células presentes en la estructura similar a la médula ósea se pueden recolectar para análisis adicionales.- Cuando el medio de cultivo se cambie 2 veces por semana, almacenar el sobrenadante recuperado del interior del inserto a -80 °C para evaluar la producción de proteínas de interés dentro del sistema.
- Disociar células de la estructura 3D (bajo una campana estéril si es necesario clasificar las células)
NOTA: Las células cultivadas en el sistema 3D similar a la médula ósea se pueden recuperar, clasificar y analizar más a fondo.- Al final del experimento, en un tubo de 15 ml, mezclar 4,5 ml de RPMI con 0,5 ml de FBS suplementado con 0,4 mg/ml de colagenasa, y calentar la solución a 37 °C durante 10 min.
- Coloque el inserto boca abajo (lado blanco de la membrana en la parte superior) en una cubierta estéril de placa de 6 pocillos para cortar la membrana correctamente. Use un bisturí estéril para cortar la membrana por los lados, recuperando así un disco sólido blanco. Colocar el disco dentro del tubo caliente de 15 ml preparado en el paso 5.2.1.
- Colocar el tubo en una rueda activa en una incubadora a 37 °C e incubar durante 10 minutos para permitir la digestión (en contacto con la colagenasa). Aplique el mismo tiempo de incubación para todas las membranas para evitar un análisis sesgado.
- Después de 10 minutos, centrifugar el tubo de 15 ml durante 5 minutos a 1.575 × g a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 5 ml de PBS 1x caliente. NOTA: En este paso, como la membrana de policarbonato generalmente flota en la fracción sobrenadante, se puede desechar utilizando una punta de pipeta estéril. Si la membrana todavía está incluida en el pellet, déjela y retírela al final del siguiente paso.
- Vuelva a suspender el pellet en 300 μL de tripsina tibia, haga un vórtice del tubo durante 10 s y colóquelo en un baño de agua a 37 °C durante 1 min.
- Detenga la digestión enzimática agregando 1 ml de FBS puro caliente. Con una micropipeta de 1 ml, aspirar mecánicamente y dispensar el medio para disociar completamente el disco.
PRECAUCIÓN: El paso de aspiración/dispensación debe ser muy rápido, de lo contrario las perlas sedimentarán dentro de la punta. - Centrifugar el tubo durante 5 min a 1.575 × g. Resuspender el pellet en 3 mL de 1x PBS suplementado con 10% de FBS.
- Deje sedimentar las perlas durante 5 s antes de recoger el sobrenadante y filtrarlo a través de un colador de células de 35 μm colocado en un tubo de recolección. Centrifugar el filtrado recuperado durante 5 min a 1.575 × g. Contar las células con azul de tripano para evaluar la viabilidad y proceder a los análisis de citometría de flujo.
NOTA: El número de células viables recuperadas después de la incubación con azul de tripano es ~1-2 × 105 células por inserto digerido.
- Marcaje por citometría de flujo de células recuperadas
NOTA: Las células recuperadas de la estructura 3D similar a la médula ósea se pueden etiquetar y analizar más a fondo mediante citometría de flujo. Utilice una mezcla de anticuerpos para detectar los diferentes compartimentos después de la disociación 3D. Aquí, CD45 (tiñe las células hematológicas de interés), CD31 (tiñe el compartimiento vascular) y CD73 (tiñe el compartimento osteoblástico) se utilizaron a 1 μL en 50 μL de PBS + 2% FBS. Mantener todas las células y anticuerpos preparados en hielo (4 °C) alejados de la luz durante todo el proceso.- Resuspenda los gránulos en la mezcla de anticuerpos e incube durante 30-40 minutos en hielo lejos de la luz.
- Añadir 1 ml de PBS + 2% FBS para lavar las células y centrifugar durante 5 min a 1.575 × g.
- Resuspender el pellet recuperado en 200 μL de 1x PBS + 10% FBS suplementado con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, diluido 1:2,000).
- Analizar los tubos en un citómetro utilizando los siguientes parámetros: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Utilice un gráfico FSC-H versus FSC-W para bloquear la población de singletes. En la fracción singlete, use un gráfico DAPI-A versus FSC-A para determinar la población de células viables (DAPI-negativo). Con la población DAPI-negativa previamente cerrada, use un gráfico APC-A versus FSC-A para determinar la población CD45-positiva.
- Fijación de la estructura 3D similar a la médula ósea
NOTA: La fijación de la estructura 3D similar a BM generalmente se realiza para inmunohistoquímica o inmunofluorescencia para visualizar células in situ y para tinción específica adicional.- Para fijar la estructura similar a BM, transfiera el inserto (paso 4.3) de la placa antigua a una nueva placa de 6 pocillos llena con 1x PBS. Luego, reemplace suavemente el medio dentro del inserto con 1x PBS.
NOTA: No enjuague la estructura formada con PBS; la presión del líquido puede perjudicar la estructura 3D. - Una vez que el inserto esté lavado, colóquelo dentro de una nueva placa de 6 pocillos y llene tanto el pocillo como el inserto con paraformaldehído (PFA) recién abierto al 4% (diluido al 16% en 1x PBS).
- Deje que el proceso de fijación continúe durante 4 h a temperatura ambiente, lejos de la luz.
- Al final del proceso de fijación, lavar el inserto una vez con 1x PBS y guárdelo a 4 °C protegido de la luz.
- Corte la membrana en la parte inferior del inserto como se describe en el paso 5.2.2 para recuperar el disco sólido.
- Incubar el disco 4 veces durante 48 h en EDTA (0,5 M, pH 8) para descalcificar la estructura.
- Incrustar la estructura en parafina y cortar secciones de 4 μm de espesor.
- Usando un inmunotinción automatizado, incubar las secciones con anticuerpos anti-CD45, anti-CD73 y Ki67. Visualizar la tinción con una peroxidasa de rábano picante anti-conejo o ratón (HRP) y con 3,3'-diaminobencidina como sustrato cromogénico y contratinción con hematoxilina de Gill.
- Para fijar la estructura similar a BM, transfiera el inserto (paso 4.3) de la placa antigua a una nueva placa de 6 pocillos llena con 1x PBS. Luego, reemplace suavemente el medio dentro del inserto con 1x PBS.
Representative Results
Usando este protocolo, es posible recapitular un microambiente mínimo, in vitro, 3D, similar al BM humano, del cual se pueden recuperar células viables de tres compartimentos celulares diferentes (Figura 1). De hecho, después de la exposición deseada, las estructuras tipo BM 3D pueden disociarse y las MSC, las células endoteliales y las células hematopoyéticas pueden evaluarse / caracterizarse mediante citometría de flujo (Figura 2A). Hasta ahora, los resultados sugieren que es posible mantener las células hematológicas durante al menos 6 semanas dentro del modelo 3D, antes de recuperar células viables (Figura 2B). Sin embargo, se requieren investigaciones futuras para estimar el límite de este modelo 3D. Además, si es necesario, es posible sustituir la línea celular HS27A con MSC primaria de médula ósea normal (NBM) o MSC de leucemia mieloide aguda (LMA) en este modelo 3D similar a BM (Figura 2C) o reemplazar la línea celular hematopoyética con HSC primarias (Figura 2D). Además, al analizar las interacciones entre compartimentos celulares o la localización de marcadores específicos de interés, las estructuras tipo BM 3D se pueden fijar y procesar posteriormente con incrustación de parafina e inmunoquímica. Por ejemplo, el análisis de los contenidos de CD45 (hematológico) o CD73 (MSC) se realizó utilizando estos modelos 3D (Figura 3).
Figura 1: Diagrama esquemático de la configuración inicial del sistema humano tipo BM 3D. Después de 3 semanas de cocultivo, se puede recolectar o sembrar tejido sólido similar a BM con células hematopoyéticas (como en el ejemplo) u otros tipos de células. Si es necesario, una vez que las células son adherentes, se puede agregar tratamiento y realizar cambios medios dos veces por semana. Al final del experimento, las estructuras similares a BM pueden fijarse y procesarse para estudios de localización o disociarse para evaluar el contenido celular. Abreviaturas: BCP = fosfato cálcico bifásico; BM = médula ósea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Recuperación de células viables de diferentes compartimentos después del cultivo en el modelo 3D tipo BM. (A) Patrón típico de recuperación celular de una estructura disociada similar a BM con 9.84% de células viables (DAPI-). Gráficos representativos de células hematopoyéticas (66,6% CD45+), células MSC/osteoblastos (88,6% células CD73+ dentro de la población CD45- y células endoteliales (22,1% células CD31+ dentro de la población CD45-) recuperadas después de la disociación 3D. (B) El sistema 3D permite el mantenimiento de células hematopoyéticas viables (CD45+) hasta 6 semanas después del cultivo. (C) Los sistemas 3D hechos de MSC primarias de NBM o AML junto con HMEC-1 (coloreado con Kusabira-Orange en este ejemplo) pueden mantener HSC (3.88% CD45 + DAPI - células) in situ (D). Abreviaturas: BM = médula ósea; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; MSC = célula madre mesenquimal; NBM = médula ósea normal; LMA = leucemia mieloide aguda; HSC = células madre hematopoyéticas; FSC = dispersión hacia adelante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visualización de las interacciones celulares y la proliferación dentro del modelo 3D tipo BM. Los sistemas se recolectaron después de 3 semanas de cocultivo 3D con HS27A y HMEC-1 y la adición de células hematopoyéticas después de 1 semana. La tinción inmunohistoquímica típica (visualizada en marrón) por IHQ se visualizó utilizando una peroxidasa de rábano picante anti-conejo o ratón y se visualizó con 3,3′-diaminobencidina como sustrato cromogénico y se contratiñó con hematoxilina de Gill y muestra la presencia de células hematopoyéticas con CD45 (panel izquierdo), células estromales con CD73 (panel medio) o proliferación de todas las células con KI67 (panel derecho). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: BM = médula ósea; IHQ = inmunohistoquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Uno de los desafíos actuales que enfrentan los estudios sobre cuestiones fisiológicas humanas y patológicas asociadas es la falta de modelos que imiten con precisión las complejas funciones de los órganos humanos. En el caso de los modelos 3D BM humanos, muchos modelos utilizan hidrogeles y reproducen parcialmente el BM, ilustrando el poder de las condiciones de cultivo 3D en comparación con los cultivos 2D clásicos para asegurar, por ejemplo, una mejor diferenciación osteoblástica27,28. Sin embargo, a pesar de la buena reproducibilidad y facilidad de uso, estos sistemas no imitan la estructura y arquitectura humana de BM 3D, lo que puede afectar significativamente a los análisis posteriores. Los avances tecnológicos han permitido a los científicos reproducir mejor el entorno de nicho osteoblástico humano nativo utilizando un sistema de biorreactor basado en perfusión para mantener algunas propiedades de HSC29. El desarrollo de dispositivos microfluídicos ha dado lugar a nuevos enfoques para reproducir una estructura similar a la médula ósea relevante, pero hasta ahora sólo han logrado características limitadas de la médula ósea, y por lo tanto han restringido las aplicaciones30,31,32,33.
Los avances en las ciencias de los materiales han contribuido al desarrollo de una amplia gama de biomateriales naturales o sintéticos, que se pueden utilizar para desarrollar sistemas de cultivo óseo 3D relevantes. Sin embargo, tales sistemas a veces son difíciles de desarrollar en laboratorios biológicos estándar sin habilidades internas en biofísica. Además, en la mayoría de los casos, estos sistemas logran una capacidad limitada para imitar la estructura 3D del hueso humano, incluido el microambiente BM, y han utilizado grandes cantidades de citoquinas y factores de crecimiento, creando un medio de cultivo artificialmente rico34.
La elección de inducir diferenciación osteoblástica en lugar de diferenciación adipocítica se basó en el hecho de que los preosteoblastos y osteoblastos han sido descritos como parte del nicho endosteal35. Esto identificó las células osteoblásticas, como componentes solicitados tanto del hueso como de la médula ósea. Entre los componentes celulares de la médula ósea, las células endoteliales y estromales ocupan una gran proporción del microambiente. Además, estos dos tipos celulares producen componentes estructurales no celulares de la matriz extracelular y citoquinas implicadas en la regulación de la homeostasis y diferenciación, solicitadas aquí para generar una estructura calcificada. Por lo tanto, esto justifica el uso de células endoteliales y estromales, y nuestra elección de líneas celulares para permitir un fácil acceso y aumentar la reproducibilidad entre laboratorios. Dado que el cultivo de la línea HMEC-1 es más estable en el tiempo, esta línea celular se mantuvo para el desarrollo del sistema 3D. Para las células del estroma, comparamos en cultivo 2D la capacidad de diferenciación osteoblástica de las líneas celulares estromales derivadas de la médula ósea normal: HS5 y HS27A. Encontramos que la línea HS5 no diferenciaba tanto como la línea HS27A en el sistema 3D generado con cualquiera de las líneas celulares. En este sentido, los intentos de reemplazar las células HS27A por la línea HS5 han resultado en la producción de una estructura menos rígida, lo que sugiere que HS27A es más adecuada.
Tanto las líneas celulares HS27A como HMEC-1 se cultivaron en diferentes combinaciones de medios, en las que se obtiene la mejor estructura rígida y alineaciones de HMEC-1 a lo largo de las estructuras osteoblásticas, de modo que la producción de la matriz extracelular aporta una rigidez relativa a la estructura básica. El análisis del avance de la diferenciación en D14 mostró que la diferenciación estaba más avanzada en D21 (medición de BSP, marcador osteoblástico tardío), con una relación 1:2 para HMEC-1:HS27A y con mejores resultados cuando se introdujeron 2 × 106 HS27A. Las células endoteliales también tienen un papel importante en la regulación de la homeostasis y la diferenciación (entre otras cosas a través del suministro de citoquinas). El hecho de que las células HMEC-1 se mantengan en este sistema indica que al menos pueden cumplir este papel, y esto contribuye a la legitimidad de nuestro modelo. Para la línea endotelial HMEC-1, era importante introducirla lo suficientemente temprano para que pudiera integrarse adecuadamente en la estructura y con la esperanza de que estas células pudieran formar alineaciones o incluso tubos dentro de la estructura. Se realizaron ensayos de cocultivo de HS27A y HMEC-1 introduciendo este último en diferentes etapas: D0, D7, D14; No se observaron diferencias notables, ni en la diferenciación de las células del estroma ni en el mantenimiento o posicionamiento de las células endoteliales. Por lo tanto, estas células se introdujeron al comienzo del proceso. Las células hematopoyéticas se introdujeron en un momento en que la diferenciación osteoblástica sería lo suficientemente avanzada como para favorecer las interacciones célula-célula. Esta elección también estuvo condicionada por el hecho de que esta diferenciación osteoblástica está condicionada por el uso de un medio, que según nuestras pruebas, no soporta completamente el mantenimiento de las células hematopoyéticas. Las células hematológicas pueden ser líneas celulares o células hematopoyéticas primarias BM CD45.
A partir de este modelo 3D, podríamos prever la sustitución de cada tipo de célula por células primarias, normales o patológicas, o incluso añadir otros tipos de células para potenciar las propiedades biomiméticas, como células inmunes, adipocitos o fibroblastos26. De hecho, la línea celular HS27A ha sido reemplazada por MSC BM primarias con baja pasabilidad. Del mismo modo, las líneas celulares hematológicas fueron reemplazadas por células hematopoyéticas primarias BM. Sin embargo, el reemplazo de células HMEC-1 por células endoteliales primarias aún no se ha probado. Actualmente, este modelo aún podría mejorarse en términos de representación de la vasculatura, ya que aunque las células endoteliales están presentes e interactúan correctamente con otras células del microambiente (por ejemplo, células hematopoyéticas), no forman vasos estructurados, lo que impide la perfusión de flujo para imitar los vasos sanguíneos funcionales. En general, esto podría aumentar progresivamente la complejidad y la representatividad del modelo 3D mínimo actual. La adición de otros tipos de células puede facilitar los estudios que investigan otros problemas, como la importancia de la inflamación local de BM o la resistencia a la inmunoterapia.
Sin embargo, este sistema 3D necesita 3 semanas antes de que se puedan agregar células de interés, células hematológicas o células de cáncer epitelial si se evalúa el proceso de metástasis. Es necesario mantener las condiciones estériles, ya que los cambios medios dos veces por semana a veces pueden conducir a una contaminación media. Además, dado que algunas células pueden migrar a través de los poros del inserto y comenzar a dispersarse en el pozo, lo que lleva a un mayor consumo de medio, se recomienda un monitoreo regular.
Describimos aquí un andamio 3D que permite la diferenciación osteoblástica y desarrollamos un microambiente relevante, in vitro, 3D, similar al BM humano. Este sistema permite el análisis in situ y la recuperación final de células vivas. Este sistema proporciona una herramienta nueva y altamente flexible, reproducible y fácil de usar, con una amplia gama de aplicaciones para estudiar las interacciones y mecanismos dentro del microambiente humano BM.
Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a P. Battiston-Montagne y A. Jambon de la plataforma de citometría CRCL y a N. Gadot y C. Leneve de la Plataforma de Patología de Investigación, Departamento de Investigación e Innovación Traslacional, Centro Léon Bérard. Los autores agradecen a B. Manship por la edición en inglés. Este trabajo fue financiado por Inserm y FI-LMC a V. M. S., y S. L. K. A. y L. B. fueron apoyados por una subvención de la Société Française d'Hématologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
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