Summary
Burada, insan kemik iliğinin in vivo yapısının karmaşıklığını yansıtan, çok çeşitli normal ve patolojik olayları ince bir şekilde incelemek için uygun bir model sağlayan, uygulaması kolay, standartlaştırılmış, mikrofizyolojik bir sistemi tanımlıyoruz.
Abstract
Medüller niş, yerleşik hücreler için homeostazı korumak için gerekli olan karmaşık bir ekosistemdir. Gerçekten de, karmaşık bir hücre dışı matris ve mezenkimal kök hücreler, osteoblastlar ve endotel hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerini içeren kemik iliği, doğrudan hücre-hücre etkileşimleri yoluyla hematopoetik kök hücre regülasyonunda ve sitokin üretiminde derinden rol oynar. Bu in vivo yapıyı yakından taklit etmek ve insan kemik iliğinin tepkilerini yansıtan deneyler yapmak için, öncelikle birincil stromal hücrelere dayanan biyomalzemelere dayanan birkaç 3D model oluşturulmuştur. Burada, kurulumu kolay ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre popülasyonlarını birleştiren ve in vivo kemik iliği dokusunun heterojenliğini yansıtan kemik iliği benzeri yapının özelliklerini sağlayan minimal ve standartlaştırılmış bir sistem elde etmek için bir protokol tanımlanmıştır. Kemik iliği mikro çevresini temsil eden kalsiyum fosfat bazlı parçacıklar ve insan hücre hatları kullanılarak bir araya getirilen bu 3D kemik iliği benzeri yapı, sistem içindeki farklı birincil hücre popülasyonlarını birleştirerek veya değiştirerek çok çeşitli biyolojik süreçlerin izlenmesine izin verir. Son 3D yapılar daha sonra fiksasyon, parafin gömme ve sistem içindeki hücre lokalizasyonu için histolojik / immünohistokimyasal boyama sonrası görüntü analizi için toplanabilir veya moleküler veya fonksiyonel karakterizasyon için her bir hücresel bileşeni toplamak üzere ayrıştırılabilir.
Introduction
Kemik iliği (BM), hem eksenel hem de uzun kemiklerin ve trabeküler düz kemiklerin merkezi boşluklarında bulunur ve çeşitli farklı hücresel ve hücresel olmayan bileşenler içerir. Yapısal düzeyde, hematopoetik doku adalarından ("hematonlar" olarak da adlandırılır)1,2 ve trabeküler kemik3 içine serpiştirilmiş vasküler sinüslerle çevrili yağ hücrelerinden oluşur. Uzun ve düz kemiklerde, kemiğe ve kemik iliğine giden kan akışı, damarlarınendosteal ağı 4 aracılığıyla birbirine bağlanır. Bu katı koruyucu ağda gizlenmiş olan BM, süngerimsi bir stromaya batırılmış çok olgunlaşmamış hücrelere ev sahipliği yapar ve yerleşik mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) ve hematopoetik kök hücrelerin (HSC'ler) farklılaşmasının yerini oluşturur5. Gerçekten de, osteoblastların üretimi yoluyla kemik dokularının yenilenmesinin yanı sıra, BM'nin bilinen ana işlevlerinden biri hematopoez gelişiminde yatmaktadır6.
BM hematopoetik dokusu, HSC'ler, öncüller ve lenfositler, nötrofiller, eritrositler, granülositler, monositler ve trombositler gibi daha farklılaşmış kan hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerini içerir7. Hematopoetik hücreler BM boşluğunda rastgele düzenlenmemiştir, ancak hematopoetik nişler içinde, farklı kökenlerden (osteoblastlar, osteoklastlar, MSC'ler, adipositler, sinüzoidal endotel ve perivasküler stromal hücreler, immün hücreler, sinir hücreleri ve belirgin olgun hematopoetik hücreler) birçok hücre tipini içeren belirli bir organizasyon gösterir8 . Hematopoetik nişin biyolojik fonksiyonları, çoklu fizyolojik veya fizyolojik olmayan streslere yanıt olarak HSC sağkalımının düzenlenmesini, yapışmasını, sessizliğini, homing'ini ve farklı mekanizmalarla (hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri, çözünür faktörlerin üretimi, hipoksi) farklılaşmasını içerir 3,6. Bu hematopoetik nişler başlangıçta homojen varlıklar olarak algılansa da, tek hücreli ve görüntüleme analizleri gibi teknolojik gelişmeler bunların karmaşıklığını, dinamiklerini ve adaptif özelliklerini giderek ortaya koymuştur 9,10,11.
İnsan fizyolojik ve patolojik süreçlerini deşifre etmek için hayvanların kullanımını değiştirme ve azaltma konusundaki kritik ihtiyaç, yeni fırsatlara ve zorluklara yol açmaktadır11,12. Yeni tanımlanan in vitro aletler arasında, in vivo insan BM'sini klasik iki boyutlu (2D) kültürlerden daha iyi taklit eden üç boyutlu (3D) modeller önerilmiştir 13,14,15,16,17. Bu nedenle 3D modelleme, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini gözlemlemek için umut verici bir yaklaşım gibi görünmektedir, in vivo olarak meydana gelenlere daha yakındır. Bu modellerin çeşitliliğini kullanarak, bazı ekipler HSC'lerin hayatta kalma ve çoğalma 18,19'unu göstermiştir. Birkaç 3D model mevcuttur, en yaygın yaklaşım, osteoblastik soy farklılaşma kapasitelerinden yararlanan MSC'lerle ilişkili hidrojeller, kolloidler veya kollajenler gibi iskele bazlı 3D biyomalzemelerin kullanılmasıdır20,21,22. Bununla birlikte, insan hücreleri üzerindeki çalışmalar için tüm gereklilikleri kullanıcı dostu ve standartlaştırılmış bir şekilde yerine getirmek için küresel bir rızaya ulaşılmamıştır23, özellikle de bu mevcut 3D sistemler esas olarak birincil stromal hücrelere dayandığından ve bu nedenle birincil örneklere, doku mevcudiyetine ve heterojenliğe sınırlı erişimden muzdarip olduklarından.
Ek olarak, endotel hücre bölmesi, bu hücreler hücre-hücre etkileşimlerinin önemli bir bileşenini temsil ettiği ve hem lösemi24 hem de metastaz25'te kök hücre kaderi ve BM hastalığı gelişiminde rol oynadığı için tanıtılmalıdır. Daha önce standartlaştırılmış bir insan 3D kemik iliği modeline patolojik elementlerin eklenmesinin, hücre dışı matriks (ECM) değişiklikleri gibi hasta örneklerinde gözlenen özellikleri özetlediğini bildirmiştik26. İnsan BM mikro çevresi ile yerleşik hücreler arasındaki dinamikleri ve etkileşimleri daha iyi anlamak için, minimal, iyi organize edilmiş, BM benzeri bir yapı oluşturmak için kullanıcı dostu ve standartlaştırılmış bir sistem için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Bu sistem üç insan kemik iliği hücre tipinden oluşur: endotel hücreleri ve mikro çevreyi temsil eden stromal hücreler ve HSC'ler. Bir iskele ve osteoblastik farklılaşma ortamı olarak belirli boncuklar kullanılarak, elde edilen 3D yapı insan medullar nişini taklit edecek ve insan kemik iliğinin kullanışlı bir şekilde incelenmesine izin verecektir.
Protocol
NOT: Kemik iliği benzeri omurga yapısını hazırlamak için, bu protokol boncukların HMEC-1 endotel hücreleri ve HS27A stromal hücreleri ile bifazik kalsiyum fosfat (BCP) boncukları üzerinde birleştirilmesine dayanır. BCP boncukları, belirli bir ortamla 3D yapısal şekillendirmeye izin veren bir iskele görevi görecektir.
1. Boncuk hazırlama ve sterilizasyon
- 1,5 mL'lik bir tüpte her kesici uç için 35-40 mg BCP boncuk (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) tartın (altta polikarbonat membranlı küçük, silindirik, plastik bir kap) (bkz. Boncukları tarttıktan sonra, otoklav döngüsü sırasında kapağın açılmasını önlemek için 1,5 mL tüpün üstünden temiz bir iğne ile küçük bir delik açın (60 dakika boyunca 121 ° C) ve tüpleri kapalı steril bir kutuda dikey bir konuma yerleştirin.
2.3D Steril bir başlık altında kesici uç hazırlığı
- Steril polikarbonat hücre kültürü eklerini 6 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Steril BCP boncuklarını 1,5 mL'lik bir tüpten kesici uca dökün. Kesici ucun içine 350 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) damlatarak boncukları dikkatlice yıkayın ve ardından kuyucuğa 4,5 mL 1x PBS ekleyin. PBS'yi vakum veya 5 mL'lik pipet kullanarak çıkarın ve ucu kuyucuğun bir köşesine yerleştirerek atın. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
- Boncuklar yıkandıktan sonra, sistemi bloke etmek için% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1x PBS kullanın. Kesici uca 350 μL blokaj çözeltisini ve kuyuya 4,5 mL'yi dikkatlice ekleyin ve tüm plakayı bir inkübatöre 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'ye yerleştirin.
NOT: Adım 2.1 ve 2.2, hücre tohumlamadan önce BCP boncuklarından iyon salınımını en aza indirmeye yardımcı olur.
3. Hücre hattı hasadı ve 3D bakım
NOT: Bu inkübasyon adımından sonra, 3D yapı omurgasını oluşturmak için mikro çevresel hücreler eklenir. Bu sistem, SV40'tan büyük T antijeni ile ölümsüzleştirilen insan mikrovasküler endotel hücreleri olan HMEC-1'in ve katı BM benzeri bir yapı oluşturma yetenekleri ve endotel hücrelerinin dahil edilmesiyle uyumlulukları nedeniyle insan papilloma virüsü ile ölümsüzleştirilen insan kemik iliği stromal hücreleri olan HS27A'nın kullanımına dayanmaktadır.
- Sisteme hücre eklemeden önce, aşağıdaki inkübasyon ortamını hazırlayın:
- 50 mL tam Osteo Farklılaşma Ortamı (ODM) için, 45 mL Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) + 5 mL FBS + 0.5 mL penisilin-streptomisin + 8 × 10-4 mg / L deksametazon + 2.16 g / L beta-gliserofosfat + 44 mg / L askorbik asit karıştırın.
- 50 mL tam HMEC-1 ortamı için, 45 mL MCDB 131 + 5 mL FBS + 0.5 mL penisilin-streptomisin +% 1 glutamin ikamesi + 1 mg / L hidrokortizon + 10 μg / L EGF karıştırın.
- Engelleme çözümünü sistemden çıkarın. 1 × 106 HMEC-1 hücreyi (vasküler bölmeyi temsil eden) ve 2 × 106 HS27A hücreyi (mezenkimal stromal hücre bölmesini temsil eden) 15 mL'lik bir tüpte karıştırın ve oda sıcaklığında 1.575 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve 175 μL ODM (HS27A osteodiferansiyasyonu için spesifik ortam) ile 175 μL HMEC-1 ortamı (HMEC-1 hücre büyümesi için spesifik ortam) ekleyin.
- Her bir kesici ucun içine 3 × 106 toplam hücre içeren bu süspansiyonun 350 μL'sini dökün. Daha sonra, kombine ortamın 4.5 mL'sini (2.25 mL HMEC-1 ortamı + 2.25 mL ODM) plakanın kuyucuklarına hücreler olmadan dökün. Kesici uç içindeki hücreleri ve BCP boncuklarını homojenize etmek için karışımı 1 mL'lik bir mikropipetle nazikçe aspire edin ve birkaç kez dağıtın. Tüm karışımı kesici ucun altına yerleşecek şekilde ayırın.
NOT: Birkaç kesici uç kültürlenmişse, bir ölü hacimli bir karışım hazırlaması önerilir. Örneğin, dört kesici uç kültürlenmişse, her zaman beş kesici uç için gereken hacmi hazırlayın. - Endotel ve mezenkimal hücreler kesici uç içinde homojenize edildikten sonra, 6 delikli plakayı bir inkübatörün içinde 37 ° C'de, 3 hafta boyunca% 5 CO2'de tutun. 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak ortamı kesici uçtan dikkatlice çıkararak ve kesici ucun köşesini rahatsız etmemek için ucu iç kesici uç duvarına yerleştirerek kesici ucun ve kuyucuğun içindeki ortamı haftada 2 kat değiştirin.
NOT: Alınan süpernatant, daha sonra protein niceliği için herhangi bir adımda -80 ° C'de saklanabilir.
4. İlgilenilen hücrelerin sisteme eklenmesi
NOT: 3 haftalık HMEC-1 ve HS27A kültürlenmesinden sonra, HS27A hücrelerinin osteodiferansiyasyonu sistemin sertleşmesini sağladı. Bu adımda, ekle ilgilenilen hematolojik hücreleri (eklenen hücrelerin sayısı 1 × 104 ila 1 × 106 arasında değişebilir) ekleyin. Eklenen hücreler, akut miyeloid lösemi hastalarından veya sağlıklı donörlerden gelen BCR-ABL onkogeni ve primer mononüklee CD34 + hücreleri ile transfekte edilen TF1 hücreleriydi.
- Bu adımda orta bileşimi değiştirin, çünkü ODM bileşiği hematolojik hücreler için toksiktir ve sistem sertleştirmesi yapıldıktan sonra eklemeye devam etmeye gerek yoktur. Örneğin, hematopoetik bakımı desteklemek için, hematopoetik hücre hatları için tam RPMI ile ODM ortamını değiştirin (RPMI, FBS'nin% 10'u ve penisilin-streptomisinin% 1'i ile desteklenir) veya birincil hematopoetik hücreler için IMDM. Haftalık 3D ortam (iki kez) değişiklikler için %50 tamamlanmış HMEC-1 ortamı ve %50 tamamlanmış RPMI/IMDM ortamından oluşan bir parti hazırlayın.
- Bu kombinasyon ortamında ilgilenilen hematolojik hücreleri yeniden askıya alın ve kesici uç içine ekleyin. Bir ilaç tedavi protokolü gerekiyorsa, tedavi etmeden önce ilgilenilen hücreleri ekledikten sonra 24 saat bekleyin ve kemik benzeri yapıya uymaları için zaman verin.
- 3D hücre kültürü dönemini gereksinimlere göre uyarlayın. Ortamı haftada iki kez yenileyin (%50 HMEC-1 tam ortam + %50 RPMI tam ortam).
NOT: 3B hücre kültürü boyunca, bazı yapışkan hücreler kesici ucun dışına kuyucukların dibine sızarak orta tüketimi artırabilir. Kesici ucun ötesinde hücre dağılımı olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin ve gerekirse kesici ucu steril bir başlığın altındaki 6 delikli yeni bir plakaya yerleştirin.
5.3D kemik iliği benzeri deneysel sonuçlar
NOT: 3B kültürlemeyi takiben, deneyin amaçlarına göre çeşitli sonuçlar elde edilebilir.
- Protein analizi
NOT: 3D deney boyunca, kemik iliği benzeri yapıda bulunan hücreler tarafından salgılanan proteinler daha ileri analizler için toplanabilir.- Kültür ortamı haftada 2 kez değiştirildiğinde, sistem içinde ilgilenilen proteinlerin üretimini değerlendirmek için alınan süpernatantı kesici ucun içinden -80 ° C'de saklayın.
- Hücreleri 3B yapıdan ayırma (hücrelerin sıralanması gerekiyorsa steril bir başlık altında)
NOT: 3D kemik iliği benzeri sistemde kültürlenen hücreler alınabilir, sıralanabilir ve daha fazla analiz edilebilir.- Deneyin sonunda, 15 mL'lik bir tüpte, 4.5 mL RPMI'yı, 0.4 mg / mL kollajenaz ile desteklenmiş 0.5 mL FBS ile karıştırın ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 37 ° C'de ısıtın.
- Membranı düzgün bir şekilde kesmek için kesici ucu baş aşağı (üstteki beyaz membran tarafı) steril 6 delikli bir plaka kapağına yerleştirin. Membranı yanlardan kesmek için steril bir neşter kullanın, böylece beyaz bir katı disk elde edin. Diski adım 5.2.1'de hazırlanan ılık 15 mL tüpün içine yerleştirin.
- Tüpü 37 ° C'lik bir inkübatörde aktif bir tekerleğe yerleştirin ve sindirime izin vermek için 10 dakika boyunca inkübe edin (kollajenaz ile temas halinde). Çarpık bir analizden kaçınmak için tüm membranlara aynı inkübasyon süresini uygulayın.
- 10 dakika sonra, 15 mL tüpü oda sıcaklığında 1.575 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanı atın ve peleti 5 mL ılık 1x PBS'de yeniden askıya alın. NOT: Bu adımda, polikarbonat membran genellikle süpernatant fraksiyonda yüzdüğü için, steril bir pipet ucu kullanılarak atılabilir. Membran hala pelet içine dahil edilmişse, bırakın ve bir sonraki adımın sonunda çıkarın.
- Peleti 300 μL ılık tripsin içinde yeniden askıya alın, tüpü 10 s boyunca vorteksleyin ve 1 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- 1 mL ılık saf FBS ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. 1 mL'lik bir mikropipetle, diski tamamen ayırmak için ortamı mekanik olarak aspire edin ve dağıtın.
DİKKAT: Aspirasyon / dağıtım adımı çok hızlı olmalıdır, aksi takdirde boncuklar ucun içinde tortu oluşturur. - Tüpü 1.575 × g'da 5 dakika santrifüj yapın. Peleti %10 FBS ile desteklenmiş 3 mL 1x PBS içinde yeniden askıya alın.
- Süpernatantı toplamadan ve bir toplama tüpüne yerleştirilmiş 35 μm hücre süzgecinden filtrelemeden önce boncukları 5 s tortuya bırakın. Alınan filtratın 1.575 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edilmesi. Canlılığı değerlendirmek için tripan mavisi olan hücreleri sayın ve akış sitometri analizlerine devam edin.
NOT: Tripan mavisi inkübasyonundan sonra alınan canlı hücrelerin sayısı, sindirilmiş kesici uç başına ~ 1-2 × 105 hücredir.
- Alınan hücrelerin akış sitometrisi etiketlemesi
NOT: 3D kemik iliği benzeri yapıdan alınan hücreler etiketlenebilir ve akış sitometrisi ile daha fazla analiz edilebilir. 3B ayrışmadan sonra farklı bölmeleri tespit etmek için antikorların bir karışımını kullanın. Burada, CD45 (ilgilenilen hematolojik hücreleri boyar), CD31 (vasküler kompartmanı boyar) ve CD73 (osteoblastik kompartmanı boyar) 50 μL PBS +% 2 FBS'de 1 μL'de kullanılmıştır. Buz üzerinde hazırlanan tüm hücreleri ve antikorları (4 °C) tüm işlem boyunca ışıktan uzak tutun.- Peletleri antikor karışımında yeniden askıya alın ve ışıktan uzakta buz üzerinde 30-40 dakika inkübe edin.
- Hücreleri yıkamak için 1 mL PBS +% 2 FBS ekleyin ve 1.575 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Alınan peleti 200 μL 1x PBS +% 10 FBS'de 4',6-diamidino-2-fenilindol ile desteklenmiş olarak yeniden askıya alın (DAPI, seyreltilmiş 1:2.000).
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak tüpleri bir sitometrede analiz edin: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Tekli popülasyonu geçmek için FSC-H ve FSC-W grafik grafiği kullanın. Tekli fraksiyonda, canlı hücre popülasyonunu (DAPI-negatif) belirlemek için bir DAPI-A ve FSC-A grafik grafiği kullanın. DAPI-negatif popülasyon daha önce kapılıyken, CD45-pozitif popülasyonu belirlemek için bir APC-A ve FSC-A grafik grafiği kullanın.
- 3D kemik iliği benzeri yapının sabitlenmesi
NOT: 3D BM benzeri yapının fiksasyonu genellikle immünohistokimya veya immünofloresan için hücreleri in situ görselleştirmek ve daha spesifik boyama için gerçekleştirilir.- BM benzeri yapıyı sabitlemek için, kesici ucu (adım 4.3) eski plakadan 1x PBS ile doldurulmuş yeni bir 6 delikli plakaya aktarın. Ardından, kesici ucun içindeki ortamı nazikçe 1x PBS ile değiştirin.
NOT: Oluşan yapıyı PBS ile yıkamayın; sıvının basıncı 3D yapıyı bozabilir. - Kesici uç yıkandıktan sonra, yeni bir 6 delikli plakaya yerleştirin ve hem kuyuyu hem de kesici ucu yeni açılmış paraformaldehit (PFA)% 4 (1x PBS'de% 16 seyreltilmiş) ile doldurun.
- Sabitleme işleminin ışıktan uzakta oda sıcaklığında 4 saat ilerlemesine izin verin.
- Fiksasyon işleminin sonunda, kesici ucu 1x PBS ile bir kez yıkayın ve ışıktan 4 °C'de saklayın.
- Katı diski almak için kesici ucun altındaki membranı adım 5.2.2'de açıklandığı gibi kesin.
- Yapıyı kireçten arındırmak için EDTA'da (0,5 M, pH 8) 48 saat boyunca diski 4x inkübe edin.
- Yapıyı parafin içine yerleştirin ve 4 μm kalınlığında bölümleri dilimleyin.
- Otomatik bir immünostainer kullanarak, bölümleri anti-CD45, anti-CD73 ve Ki67 antikorları ile inkübe edin. Boyama işlemini bir anti-tavşan veya -fare at turpu peroksidaz (HRP) ve kromojenik bir substrat olarak 3,3'-diaminobenzidin ile görselleştirin ve Gill's-hematoksilin ile karşı lekeleyin.
- BM benzeri yapıyı sabitlemek için, kesici ucu (adım 4.3) eski plakadan 1x PBS ile doldurulmuş yeni bir 6 delikli plakaya aktarın. Ardından, kesici ucun içindeki ortamı nazikçe 1x PBS ile değiştirin.
Representative Results
Bu protokolü kullanarak, üç farklı hücre bölmesinden canlı hücrelerin alınabileceği minimal, in vitro, 3D, insan BM benzeri bir mikro ortamı özetlemek mümkündür (Şekil 1). Gerçekten de, istenen maruziyetten sonra, 3D BM benzeri yapılar ayrışabilir ve MSC'ler, endotel hücreleri ve hematopoetik hücreler akış sitometrisi kullanılarak değerlendirilebilir / karakterize edilebilir (Şekil 2A). Şimdiye kadar, sonuçlar, canlı hücreleri almadan önce, hematolojik hücreleri 3D model içinde en az 6 hafta boyunca korumanın mümkün olduğunu göstermektedir (Şekil 2B). Bununla birlikte, bu 3B modelin sınırını tahmin etmek için gelecekteki araştırmalar gereklidir. Ek olarak, gerekirse, bu 3D BM benzeri modelde HS27A hücre hattını primer Normal Kemik İliği (NBM) MSC veya Akut Miyeloid Lösemi (AML) MSC ile değiştirmek veya hematopoetik hücre hattını birincil HSC'lerle değiştirmek mümkündür (Şekil 2D). Ayrıca, hücre bölmeleri arasındaki etkileşimleri veya ilgilenilen spesifik belirteçlerin lokalizasyonunu analiz ederken, 3D BM benzeri yapılar parafin gömme ve immünokimya ile sabitlenebilir ve daha fazla işlenebilir. Örneğin, CD45 (hematolojik) veya CD73 (MSC) içeriğinin analizi bu 3D modeller kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Şekil 3).
Şekil 1: İnsan 3D BM benzeri sistemin ilk kurulumunun şematik diyagramı. 3 haftalık ko-kültürden sonra, katı BM benzeri doku, hematopoetik hücrelerle (örnekte olduğu gibi) veya diğer hücre tipleriyle toplanabilir veya tohumlanabilir. Gerekirse, hücreler yapıştıktan sonra, tedavi eklenebilir ve haftada iki kez orta değişiklikler yapılabilir. Deneyin sonunda, BM benzeri yapılar lokalizasyon çalışmaları için sabitlenebilir ve daha fazla işlenebilir veya hücre içeriğini değerlendirmek için ayrıştırılabilir. Kısaltmalar: BCP = bifazik kalsiyum fosfat; BM = kemik iliği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BM benzeri 3D modelinde kültürden sonra farklı bölmelerden canlı hücrelerin geri kazanımı. (A) Canlı hücrelerin% 9.84'ü (DAPI-) ile ayrışmış BM benzeri bir yapıdan tipik hücre geri kazanımı paterni. Hematopoetik (% 66.6 CD45 +), MSC / osteoblast hücreleri (CD45 popülasyonundaki % 88.6 CD73 + hücreleri) ve endotel hücrelerinin (CD45 popülasyonundaki % 22.1 CD31 + hücreleri) temsili grafikleri 3D ayrışmadan sonra iyileşti. (B) 3D sistem, canlı hematopoetik hücrelerin (CD45 +) kültürden 6 hafta sonrasına kadar korunmasına izin verir. (C) HMEC-1 (bu örnekte Kusabira-Turuncu ile renklendirilmiş) ile birlikte NBM veya AML'den birincil MSC'lerden yapılmış 3D sistemler, HSC'leri (% 3.88 CD45 + DAPI- hücreleri) yerinde (D) tutabilir. Kısaltmalar: BM = kemik iliği; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; MSC = mezenkimal kök hücre; NBM = normal kemik iliği; AML = akut miyeloid lösemi; HSC'ler = hematopoetik kök hücreler; FSC = ileri dağılım. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: BM benzeri 3D modelde hücre etkileşimlerinin ve proliferasyonun görselleştirilmesi. Sistemler HS27A ve HMEC-1 ile 3 haftalık 3D ko-kültür ve 1 hafta sonra hematopoetik hücrelerin eklenmesinden sonra toplandı. IHC tarafından tipik immünohistokimya boyama (kahverengi olarak görselleştirilmiş), bir anti-tavşan veya -fare at turpu peroksidaz kullanılarak görselleştirildi ve kromojenik bir substrat olarak 3,3′-diaminobenzidin ile görselleştirildi ve Gill's-hematoksilin ile karşı boyandı ve CD45 (sol panel) ile hematopoetik hücrelerin, CD73 (orta panel) ile stromal hücrelerin veya KI67 (sağ panel) ile tüm hücrelerin proliferasyonunun varlığını gösterdi. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: BM = kemik iliği; IHC = immünohistokimya. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
İnsan fizyolojik ve ilişkili patolojik konular üzerine yapılan çalışmaların karşılaştığı mevcut zorluklardan biri, insan organlarının karmaşık işlevlerini doğru bir şekilde taklit eden modellerin eksikliğidir. İnsan BM 3D modelleri söz konusu olduğunda, birçok model hidrojeller kullanır ve BM'yi kısmen yeniden üretir, bu da örneğin daha iyi bir osteoblastik farklılaşma 27,28 sağlamak için klasik2D kültürlere kıyasla 3D kültür koşullarının gücünü gösterir. Bununla birlikte, iyi tekrarlanabilirlik ve kullanım kolaylığına rağmen, bu sistemler insan BM 3D yapısını ve mimarisini taklit etmez ve bu da daha sonraki analizleri önemli ölçüde etkileyebilir. Teknolojik gelişmeler, bilim adamlarının bazı HSC özelliklerini korumak için perfüzyon tabanlı bir biyoreaktör sistemi kullanarak yerli insan osteoblastik niş ortamını daha iyi yeniden üretmelerini sağlamıştır29. Mikroakışkan cihazların geliştirilmesi, ilgili kemik iliği benzeri bir yapıyı yeniden üretmek için yeni yaklaşımlara yol açmıştır, ancak şimdiye kadar kemik iliğinin yalnızca sınırlı özelliklerini elde etmiş ve bu nedenle uygulamaları kısıtlamıştır30,31,32,33.
Malzeme bilimlerindeki ilerlemeler, ilgili 3D kemik kültürü sistemlerini geliştirmek için kullanılabilecek çok çeşitli doğal veya sentetik biyomalzemelerin geliştirilmesine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, bu tür sistemlerin biyofizikte kurum içi becerileri olmayan standart biyolojik laboratuvarlarda geliştirilmesi bazen zordur. Dahası, çoğu durumda, bu sistemler BM mikro ortamı da dahil olmak üzere insan kemiğinin 3D yapısını taklit etmek için sınırlı bir yetenek elde eder ve yapay olarak zengin bir kültür ortamı yaratarak büyük miktarda sitokin ve büyüme faktörü kullanmıştır34.
Adipositik farklılaşma yerine osteoblastik farklılaşmayı indükleme seçimi, preosteoblastların ve osteoblastların endosteal niş35'in bir parçası olarak tanımlanmasına dayanıyordu. Bu, osteoblastik hücreleri hem kemik hem de kemik iliğinin istenen bileşenleri olarak tanımladı. Kemik iliğinin hücresel bileşenleri arasında, endotel ve stromal hücreler mikro çevrenin büyük bir bölümünü kaplar. Ek olarak, bu iki hücre tipi, kalsifiye bir yapı oluşturmak için burada talep edilen homeostaz ve farklılaşmanın düzenlenmesinde rol oynayan hücre dışı matriksin ve sitokinlerin yapısal hücresel olmayan bileşenlerini üretir. Bu nedenle, bu, endotel ve stromal hücrelerin kullanımını ve kolay erişim sağlamak ve laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği artırmak için hücre hatları seçimimizi haklı çıkarır. HMEC-1 hattının kültürü zamanla daha kararlı hale geldiğinden, bu hücre hattı 3D sistemin geliştirilmesi için korundu. Stromalik hücreler için, 2D kültürde normal kemik iliğinden türetilen stromal hücre hatlarının osteoblast farklılaşma kapasitesini karşılaştırdık: HS5 ve HS27A. HS5 hattının, her iki hücre çizgisiyle oluşturulan 3D sistemdeki HS27A çizgisi kadar farklılaşmadığını bulduk. Bu bağlamda, HS27A hücrelerini HS5 hattı ile değiştirme girişimleri, HS27A'nın daha uygun olduğunu düşündüren daha az sert bir yapının üretilmesiyle sonuçlanmıştır.
Hem HS27A hem de HMEC-1 hücre hatları, HMEC-1'in osteoblast yapıları boyunca en iyi sert yapısını ve hizalamalarını ortaya çıkardığı farklı ortam kombinasyonlarında kültürlenmiştir, böylece hücre dışı matrisin üretimi temel yapıya göreceli bir sertlik getirmektedir. D14'te farklılaşmanın ilerlemesinin analizi, farklılaşmanın D21'de (BSP ölçümü, geç osteoblastik belirteç), HMEC-1: HS27A için 1: 2 oranında ve 2 × 106 HS27A tanıtıldığında daha iyi sonuçlarla daha gelişmiş olduğunu göstermiştir. Endotel hücreleri ayrıca homeostazı ve farklılaşmayı düzenlemede önemli bir role sahiptir (diğer şeylerin yanı sıra sitokinlerin temini yoluyla). HMEC-1 hücrelerinin bu sistemde muhafaza edilmesi, en azından bu rolü yerine getirebileceklerini gösteriyor ve bu da modelimizin meşruiyetine katkıda bulunuyor. HMEC-1 endotel hattı için, yapıya düzgün bir şekilde entegre edilebilmesi ve bu hücrelerin yapı içinde hizalamalar ve hatta tüpler oluşturabileceği umuduyla yeterince erken tanıtılması önemliydi. HS27A ve HMEC-1'in ko-kültür testleri, ikincisi farklı aşamalarda tanıtılarak gerçekleştirildi: D0, D7, D14; ne stromal hücrelerin farklılaşmasında ne de endotel hücrelerinin korunmasında veya konumlandırılmasında kayda değer bir fark gözlenmedi. Böylece, bu hücreler sürecin başında tanıtıldı. Hematopoetik hücreler, osteoblastik farklılaşmanın hücre-hücre etkileşimlerini destekleyecek kadar gelişmiş olacağı bir zamanda tanıtıldı. Bu seçim aynı zamanda, bu osteoblastik farklılaşmanın, testlerimize göre, hematopoetik hücrelerin bakımını tam olarak desteklemeyen bir ortamın kullanılmasıyla şartlandırılması gerçeğiyle de şartlandırılmıştır. Hematolojik hücreler hücre hatları veya primer BM CD45 hematopoetik hücreler olabilir.
Bu 3D modelden, her hücre tipinin normal veya patolojik birincil hücrelerle değiştirilmesini veya hatta bağışıklık hücreleri, adipositler veya fibroblastlar gibi biyomimetik özellikleri artırmak için başka hücre tipleri eklemeyi öngörebiliriz26. Aslında, HS27A hücre hattı, düşük geçişli birincil BM MSC'lerle değiştirilmiştir. Benzer şekilde, hematolojik hücre hatları primer BM hematopoetik hücrelerle değiştirildi. Bununla birlikte, HMEC-1 hücrelerinin primer endotel hücreleri ile değiştirilmesi henüz test edilmemiştir. Şu anda, bu model vaskülatür temsili açısından hala geliştirilebilir, çünkü endotel hücreleri mevcut olmasına ve mikroçevreden diğer hücrelerle (örneğin, hematopoetik hücreler) doğru bir şekilde etkileşime girmesine rağmen, yapılandırılmış damarlar oluşturmazlar, böylece fonksiyonel kan damarlarını taklit etmek için akış perfüzyonunu önlerler. Genel olarak, bu, mevcut minimum 3B modelin karmaşıklığını ve temsiliyetini kademeli olarak artırabilir. Diğer hücre tiplerinin eklenmesi, lokal BM inflamasyonunun önemi veya immünoterapiye direnç gibi diğer konuları araştıran çalışmaları kolaylaştırabilir.
Bununla birlikte, bu 3D sistemin ilgilendiği hücrelerin, metastaz sürecinin değerlendirilmesi durumunda hematolojik hücrelerin veya epitel kanseri hücrelerinin eklenebilmesi için 3 haftaya ihtiyacı vardır. Steril koşulların korunması gerekir, çünkü haftada iki kez orta değişiklikler bazen orta kontaminasyona neden olabilir. Ayrıca, bazı hücreler kesici ucun gözeneklerinden geçip kuyuya dağılmaya başlayabileceğinden, orta tüketimin artmasına neden olabileceğinden, düzenli izleme önerilir.
Burada osteoblastik farklılaşmaya izin veren bir 3D iskele tanımladık ve in vitro , 3D, insan BM benzeri bir mikro çevre geliştirdik. Bu sistem yerinde analize ve nihai canlı hücre alımına izin verir. Bu sistem, insan BM mikro ortamındaki etkileşimleri ve mekanizmaları incelemek için geniş bir uygulama yelpazesine sahip, tekrarlanabilir ve kullanıcı dostu yeni ve son derece esnek bir araç sağlar.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
CRCL sitometri platformundan P. Battiston-Montagne ve A. Jambon'a ve Araştırma Patolojisi Platformu, Translasyonel Araştırma ve İnovasyon Bölümü, Centre Léon Bérard'dan N. Gadot ve C. Leneve'e teşekkür ederiz. Yazarlar İngilizce baskısı için B. Manship'e minnettardır. Bu çalışma Inserm ve FI-LMC tarafından V. M. S.'ye finanse edildi ve S. L. K. A. ve L. B. Société Française d'Hématologie'den bir hibe ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
- Janel, A., et al. Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche. American Journal of Hematology. 92 (10), 1020-1031 (2017).
- Blazsek, I., et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. Experimental Hematology. 23 (4), 309-319 (1995).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Kopp, H. -G., Avecilla, S. T., Hooper, A. T., Rafii, S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology. 20 (5), 349-356 (2005).
- Hawley, R. G., Ramezani, A., Hawley, T. S. Hematopoietic stem cells. Methods in Enzymology. 419, 149-179 (2006).
- Gulati, G. L., Ashton, J. K., Hyun, B. H. Structure and function of the bone marrow and hematopoiesis. Hematology/Oncology Clinics of North America. 2 (4), 495-511 (1988).
- Dean, L. Blood and the Cells it Contains. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ (2005).
- Kandarakov, O., Belyavsky, A., Semenova, E. Bone marrow niches of hematopoietic stem and progenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4462 (2022).
- Batsivari, A., et al. Dynamic responses of the haematopoietic stem cell niche to diverse stresses. Nature Cell Biology. 22 (1), 7-17 (2020).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Tjin, G., et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies. Bone. 119, 19-35 (2019).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (5), 345-361 (2021).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Walasek, M. A., van Os, R., de Haan, G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Annals of the New York Academy of Sciences. 1266 (1), 138-150 (2012).
- Discher, D., et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Annals of Biomedical Engineering. 37 (5), 847-859 (2009).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Gamblin, A. L., et al. Osteoblastic and osteoclastic differentiation of human mesenchymal stem cells and monocytes in a miniaturized three-dimensional culture with mineral granules. Acta Biomaterialia. 10 (12), 5139-5147 (2014).
- Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
- Taqvi, S., Roy, K. Influence of scaffold physical properties and stromal cell coculture on hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6024-6031 (2006).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Kotha, S. S., et al. Engineering a multicellular vascular niche to model hematopoietic cell trafficking. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 77 (2018).
- Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (6), 1256-1261 (2018).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, J. H. D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 28-35 (2005).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Kusumbe, A. P. Vascular niches for disseminated tumour cells in bone. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 112-116 (2016).
- Voeltzel, T., et al. A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes. Biomaterials Science. 10 (2), 485-498 (2022).
- Costantini, M., et al. 3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitro neocartilage formation. Biofabrication. 8 (3), 035002 (2016).
- Chatterjee, K., et al. The effect of 3d hydrogel scaffold modulus on osteoblast differentiation and mineralization revealed by combinatorial screening. Biomaterials. 31 (19), 5051-5062 (2010).
- Bourgine, P. E., et al. In vitro biomimetic engineering of a human hematopoietic niche with functional properties. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (25), 5688-5695 (2018).
- Carvalho, M. R., Reis, R. L., Oliveira, J. M. Mimicking the 3D biology of osteochondral tissue with microfluidic-based solutions: breakthroughs towards boosting drug testing and discovery. Drug Discovery Today. 23 (3), 711-718 (2018).
- de al Puente, P., et al. 3D tissue-engineered bone marrow as a novel model to study pathophysiology and drug resistance in multiple myeloma. Biomaterials. 73, 70-84 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Mansoorifar, A., Gordon, R., Bergan, R., Bertassoni, L. E. Bone-on-a-chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue. Advanced Functional Materials. 31 (6), 2006796 (2021).
- Nelson, M. R., et al. A multi-niche microvascularized human bone marrow (hBM) on-a-chip elucidates key roles of the endosteal niche in hBM physiology. Biomaterials. 270, 120683 (2021).
- Galán-Díez, M., Kousteni, S. The osteoblastic niche in hematopoiesis and hematological myeloid malignancies. Current Molecular Biology Reports. 3 (2), 53-62 (2017).
