Summary

Desenho e Implementação de um Modelo de Perfusão Pulmonar Ex Vivo de Rato

Published: May 26, 2023
doi:

Summary

Os pulmões ex vivo são úteis para uma variedade de experimentos para coletar dados fisiológicos, excluindo as variáveis de confusão dos experimentos in vivo . As configurações comerciais geralmente são caras e limitadas nos tipos de dados que podem coletar. Descrevemos um método para construir uma configuração totalmente modular, adaptável para vários projetos de estudo.

Abstract

As preparações pulmonares ex vivo são um modelo útil que pode ser traduzido para muitos campos diferentes de pesquisa, complementando os modelos in vivo e in vitro correspondentes. Os laboratórios que desejam usar pulmões isolados precisam estar cientes das etapas importantes e dos desafios inerentes para estabelecer uma configuração acessível, confiável e que possa ser facilmente adaptada para se adequar ao tópico de interesse. Este artigo descreve um modelo DIY (faça você mesmo) para ventilação e perfusão pulmonar ex vivo de ratos para estudar os efeitos de drogas e gases no tônus vascular pulmonar, independentemente de alterações no débito cardíaco. A criação deste modelo inclui a) o projeto e a construção do aparelho e b) o procedimento de isolamento pulmonar. Esse modelo resulta em uma configuração mais econômica do que as alternativas comerciais e, no entanto, modular o suficiente para se adaptar a mudanças em questões específicas de pesquisa. Vários obstáculos tiveram que ser resolvidos para garantir um modelo consistente que seja capaz de ser usado para uma variedade de tópicos de pesquisa diferentes. Uma vez estabelecido, esse modelo provou ser altamente adaptável a diferentes questões e pode ser facilmente alterado para diferentes campos de estudo.

Introduction

As técnicas de perfusão pulmonar ex vivo (EVLP)1 tiveram um aumento no uso na última década como meio de estudar transplantes pulmonares2, isquemia/reperfusão3, metabolismo pulmonar4 e respostas imunes5. Pulmões isolados, mas intactos, ventilados e perfundidos oferecem a capacidade criticamente importante de avaliar diretamente a resposta dos pulmões, incluindo a vasculatura pulmonar, a possíveis intervenções e/ou terapêuticas sem potenciais fatores de confusão, como entrada neuronal e hormonal ou alteração hemodinâmica in vivo. Ao mesmo tempo, eles mantêm a interação fisiológica de ventilação e perfusão, em contraste com as condições in vitro. Uma proposta que analisa as respostas imunes nos pulmões5, por exemplo, precisa da mesma qualidade de dados que um estudo focado em aumentar o tamanho do pool de doadores6 para transplantes de pulmão. A EVLP pode ser usada em uma variedade de espécies, incluindo camundongos3, ratos 7,8,9,10,11,12, porcos 13 e humanos 2. Portanto, é necessário estabelecer um modelo que possa produzir dados confiáveis a partir de uma variedade de parâmetros experimentais diferentes. A relevância clínica será gerada em estudos subsequentes usando o modelo EVLP como ferramenta.

Embora as configurações comerciais estejam disponíveis para compra para a maioria das espécies, elas geralmente podem ter um custo proibitivo e confinar os pesquisadores a uma marca específica de equipamento e software proprietário. Qualquer desvio da configuração pronta para uso (por exemplo, ir de uma espécie para outra) requer previsão e trabalho em torno da configuração fornecida, o que pode ser difícil ou impossível. A seguir, uma configuração DIY (faça você mesmo) para pulmões isolados de ratos que é modular e econômica, bem como o procedimento cirúrgico para isolar os pulmões, são descritos.

Protocol

A parte in vivo dos experimentos (da anestesia geral à eutanásia) requer aprovação prévia do respectivo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados (número de protocolo M1700168) pela IACUC no Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee, e foram realizados em conformidade com as diretrizes ARRIVE14. Antes da experimentação, todos os ratos foram alojados nas instalações de cuidados com animais do…

Representative Results

Após 10 min de estabilização e leituras basais, randomizamos um primeiro conjunto de 10 ratos Sprague Dawley machos em cinco pequenos grupos: isquemia global sem fluxo por 5, 7,5, 8, 9 ou 10 min (n = 2 por grupo) seguida de reperfusão; Esses experimentos preliminares limitados de determinação de dose foram conduzidos para identificar o maior tempo de isquemia possível para ainda permitir ventilação e reperfusão suficientes antes do eventual desenvolvimento de um aumento precipitado e irreversível na pressão d…

Discussion

Mais de 100 experimentos foram realizados com sucesso em nosso laboratório usando essa configuração. O design modular desta configuração personalizada deu grande flexibilidade a possíveis mudanças nos requisitos experimentais. Enquanto outras configurações utilizam um desoxigenador18 para imitar o consumo constante de oxigênio e a produção de CO2 pelos órgãos-alvo, esse modelo simplificado não empregou esse recurso, devido ao foco no estudo dos efeitos de diferentes compo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O apoio foi fornecido, em parte, por um Prêmio de Revisão de Mérito (101 BX003482) do Serviço de P&D do Laboratório Biomédico do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA, uma doação do NIH (5R01 HL123227), um Prêmio de Projeto Transformativo (962204) da American Heart Association e por fundos institucionais concedidos ao Dr. Riess. O Dr. Balzer recebeu financiamento não relacionado da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa), projeto número BA 6287/1-1. Os autores gostariam de agradecer a Matthew D. Olsen, Chun Zhou, Zhu Li e Rebecca C. Riess por suas valiosas contribuições para o estudo.

Materials

1,000 mL Glass Beaker Pyrex, Chicago, IL
1,500 mL Glass Beaker Pyrex, Chicago, IL
Air Trap Compliance Chamber Radnoti 130149
Bioamplifiers CWE Inc BPM-832
Clamps Fisher Scientific S02626
DAQ (Data Acquisition) National Instruments, Austin, TX NI USB-6343
Gas Mixer CWE Inc, Ardmore, PA GSM-4
Heating Coil Radnoti, Covina, CA 158822
Heating Plate Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 11-100-49SH
Heparin Pfizer W63422
LabVIEW Full Development System 2014 National Instruments
Pentobarbital Diamondback Drugs G2270-0235-50
pH700 Probe OAKTON, Vernon Hills, IL  EW-35419-10
Polystat Water Bath Cole-Parmer EW-12121-02
Rodent Ventilator Harvard Apparatus, Holliston, MA Model 683
Roller Pump Cole-Parmer, Wertheim, Germany  Ismatec REGLO Digital MS 2/8
Sprague Dawley Rat Charles River, Wilmington, MA Strain code 001
VetScan i-STAT Abraxis, Chicago, IL i-STAT 1

References

  1. Uhlig, S., Taylor, A. E. . Methods in Pulmonary Research. , (1998).
  2. Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125 (2019).
  3. Stone, M. L., et al. Ex vivo perfusion with adenosine A2A receptor agonist enhances rehabilitation of murine donor lungs after circulatory death. Transplantation. 99 (12), 2494-2503 (2015).
  4. Valenza, F., et al. The consumption of glucose during ex vivo lung perfusion correlates with lung edema. Transplantation Proceedings. 43 (4), 993-996 (2011).
  5. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95 (2), 196-203 (2004).
  6. McAuley, D. F., et al. Clinical grade allogeneic human mesenchymal stem cells restore alveolar fluid clearance in human lungs rejected for transplantation. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (9), L809-L815 (2014).
  7. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).
  8. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).
  9. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
  10. Bassani, G. A., et al. Ex vivo lung perfusion in the rat: detailed procedure and videos. PLoS One. 11 (12), e0167898 (2016).
  11. Watson, K. E., Segal, G. S., Conhaim, R. L. Negative pressure ventilation enhances acinar perfusion in isolated rat lungs. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217753596 (2018).
  12. Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).
  13. Hozain, A. E., et al. Multiday maintenance of extracorporeal lungs using cross-circulation with conscious swine. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (4), 1640-1653 (2020).
  14. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
  15. van Zanden, J. E., Leuvenink, H. G. D., Verschuuren, E. A. M., Erasmus, M. E., Hottenrott, M. C. A translational rat model for ex vivo lung perfusion of pre-injured lungs after brain death. PLoS One. 16 (12), e0260705 (2021).
  16. Cleveland, W. J., et al. Implementation of LabVIEW as a virtual instrument in a cost-effective isolated lung setup. The FASEB Journal. 33 (1), 846 (2019).
  17. Jamieson, S. W., Stinson, E. B., Oyer, P. E., Baldwin, J. C., Shumway, N. E. Operative technique for heart-lung transplantation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 87 (6), 930-935 (1984).
  18. Liu, M., et al. Alterations of nitric oxide synthase expression and activity during rat lung transplantation. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 278 (5), L1071-L1081 (2000).
  19. Riess, M. L., et al. Glucose measurements in blood-free balanced salt solutions with three devices (i-STAT®, glucose test strips and ACCU-CHEK® Aviva). Anesthesia and Analgesia. 128 (5), 924 (2019).
  20. Menezes, A. Q., et al. Comparison of Celsior and Perfadex lung preservation solutions in rat lungs subjected to 6 and 12 hours of ischemia using an ex-vivo lung perfusion system. Clinics. 67 (11), 1309-1314 (2012).
  21. Riess, M. L., et al. Electrolyte measurements in blood-free balanced salt solutions – comparison of i-STAT® with ABL80. Anesthesia and Analgesia. 130 (5), 984 (2020).

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Cite This Article
Cleveland, W. J., Hees, J. E., Balzer, C., Douglas, H. F., Stevens, T., Riess, M. L. Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model. J. Vis. Exp. (195), e64740, doi:10.3791/64740 (2023).

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