修飾酵素結合免疫吸着アッセイを用いたヒト血漿中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の検出と定量(英語)
Summary
ヒト血漿中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)濃度に関する公表されたデータは一貫していません。.これらの不一致は、この神経ペプチドを定量するための標準化された検証済みの方法論の欠如が原因である可能性があります。ここでは、ヒト血漿中のCGRPを精製および定量するための検証済みの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)プロトコルについて説明します。
Abstract
カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、片頭痛の病態生理学において推定上の役割を果たす血管作動性神経ペプチドであり、バイオマーカー状態の候補となる可能性があります。CGRPは活性化時にニューロン線維から放出され、三叉神経支配を受ける血管系に無菌の神経原性炎症および動脈血管拡張を誘発する。末梢血管系におけるCGRPの存在は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などのプロテオミクスアッセイを使用して、ヒト血漿中のこの神経ペプチドを検出および定量するための研究に拍車をかけました。しかし、その半減期は6.9分であり、アッセイプロトコルの技術的詳細のばらつきは、しばしば完全には説明されていないため、文献では一貫性のないCGRP ELISAデータが得られています。ここでは、ヒト血漿中のCGRPの精製および定量のための修正ELISAプロトコルが提示されている。手順ステップには、サンプルの収集と調製、精製手段としての極性吸着剤を使用した抽出、非特異的結合をブロックするための追加ステップ、およびELISA による 定量が含まれます。さらに、このプロトコルは、希釈実験のスパイクと回収率および直線性で検証されています。この検証されたプロトコルは、理論的には、片頭痛だけでなく、CGRPが役割を果たす可能性のある他の疾患の個人の血漿中のCGRP濃度を定量化するために使用できます。
Introduction
カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、血管周囲局在を有する神経線維および非神経組織に存在する37アミノ酸神経ペプチドである。CGRPの2つの形態、α-とβ-CGRPは、90%以上の相同性を共有し、生理学的機能を共有しています。しかし、αCGRPは中枢神経系および末梢神経系に見られ、βCGRPは腸神経系に見られます1,2。侵害受容器の活性化およびカルシウム依存性エキソサイトーシスにより、CGRPはニューロンから放出され、動脈血管拡張および血漿タンパク質溢出を含む無菌性神経原性炎症を誘発する3、4、5、6、7。ここから、CGRPは毛細血管後血管に現れ、片頭痛などの求心性侵害受容活性化を引き起こす疾患のバイオマーカーとなる可能性があります8、9、10、11。注目すべきことに、CGRPは血管新生と免疫調節におけるその役割を通じてCOVID-19にも関与しており、好ましくない疾患の進化を予測する可能性があります12,13。したがって、ヒト血漿中のCGRPを正確に定量するためのプロトコルは、幅広い価値を持つ可能性があります。
おそらく片頭痛におけるCGRPの役割に最も注目されています。前臨床および臨床試験に基づいて、CGRPは片頭痛の可能性のあるバイオマーカーとして、また治療の標的として提示されています3,4,5,6,7,8,9,10。いくつかの研究では、対照参加者と比較して、一時的な片頭痛のあるコホートでCGRPの上昇が見られました10、14、15。片頭痛治療の臨床試験におけるCGRP阻害剤の成功は、片頭痛の原因因子としてCGRPの上昇を示唆しているようです。ただし、すべての研究者がこれらの結果を裏付けているわけではありません16、17、18、19。さらに、片頭痛の非頭痛症状におけるCGRPの役割はまだ解明されていません。現在の研究は、片頭痛の前庭症状におけるCGRPの役割を理解したいという願望によって動機付けられました。
文献中のCGRPイムノアッセイデータの不一致は、いくつかの理由による可能性があります。第一に、末梢血管系におけるCGRPの半減期は、セリンプロテアーゼ21、インスリン分解酵素および他のメタロプロテアーゼ22、中性エンドペプチダーゼ23、およびエンドセリン変換酵素-1 24の活性により、6.9分20である。第二に、CGRPを定量するために使用されるイムノアッセイの可変的な技術的詳細は、そのような研究では完全には説明されていません。最後に、イムノアッセイ方法論の標準化の欠如は、状況をさらに複雑にします。
この記事では、ヒト血漿中のαおよびβCGRPの精製と正確な定量を可能にする修正酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)プロトコルについて説明します。キットの抗体は、アミリン、カルシトニン、またはサブスタンスPと交差反応性がありません。このプロトコルは、スパイクと回復、希釈の直線性など、必要な検証実験を経ており、そのデータはここに示されています。検証を受けたこのようなCGRP ELISAプロトコルは、これまで文献に完全には記載されていない。このプロトコルは、片頭痛、心臓病学2,25、皮膚科26、産科27、リウマチ28,29、筋骨格30,31、内分泌32,33、およびCGRPが関与しているウイルス性疾患12,13の状況において、ヒト血漿中のCGRPを定量するために使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、ヒト血漿中のCGRPの検出と定量を可能にする検証済みのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、市販のCGRP ELISAキットがこの分子を正確に定量しないことが判明した後に合成されました。サンプル調製プロトコルと有効な標準曲線を確立した後、スパイクと回収率、および希釈実験の直線性は、回収率が予想よりもはるかに低いことを示しました。同様の結果が、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルに関して有益な議論をしてくれたRobert N. Cole、Lauren R. DeVine、Marcos Iglesiasに感謝します。これは、米国耳科学会(フェローシップグラント、PSK)、米国聴覚研究財団(90066548/90072266、JPC)、および国立衛生研究所(NIH)の構成要素である国立トランスレーショナルサイエンス推進センター(NCATS)、およびNIH医学研究ロードマップ(UL1 TR003098、NSF)からの資金提供によって部分的に支援されました。出版物の内容は著者の責任であり、必ずしもジョンズホプキンスICTR、NCATS、またはNIHの公式見解を表すものではありません。
Materials
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus – Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch’ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -. G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat’s knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -. E., Kim, S. Y., Shin, S. -. Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -. C., Kuo, P. -. H., Lee, M. T., Chang, S. -. H., Chiou, L. -. C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
