På grunn av sin allsidige anvendelse som modellart i ulike fagområder, er det behov for en genetisk transformasjonsverktøykasse i smalbladet plantain (Plantago lanceolata). Her, ved bruk av Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon, presenteres en protokoll som resulterer i stabile transgene linjer med en transformasjonseffektivitet på 20%.
Artene i slekten Plantago har flere unike egenskaper som har ført til at de er tilpasset som modellplanter i ulike fagfelt. Mangelen på et genetisk manipulasjonssystem forhindrer imidlertid grundig undersøkelse av genfunksjon, og begrenser allsidigheten til dette slaget som modell. Her presenteres en transformasjonsprotokoll for Plantago lanceolata, den mest studerte Plantago-arten. Ved bruk av Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon ble 3 uker gamle røtter av aseptisk dyrkede P. lanceolata-planter infisert med bakterier, inkubert i 2-3 dager, og deretter overført til et skuddinduksjonsmedium med passende antibiotikavalg. Skudd kom typisk ut av mediet etter 1 måned, og røttene utviklet seg 1-4 uker etter at skuddene ble overført til rotinduksjonsmediet. Plantene ble deretter akklimatisert til et jordmiljø og testet for tilstedeværelse av et transgen ved hjelp av β-glukuronidase (GUS) reporteranalysen. Transformasjonseffektiviteten til den nåværende metoden er ~ 20%, med to transgene planter som dukker opp per 10 rotvev transformert. Etablering av en transformasjonsprotokoll for smalbladet plantain vil lette adopsjonen av denne planten som en ny modellart i ulike områder.
Konseptet med å bruke modellarter for å undersøke flere aspekter av plantebiologi dukket opp med den utbredte bruken av Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis ble opprinnelig valgt fordi den deler egenskaper med mange andre blomstrende planter og har flere egenskaper som gjør det praktisk å studere i et laboratoriemiljø, for eksempel å være liten og ha en kort generasjonssyklus. Det store volumet av forskningsartikler publisert med det som emne, sammen med sin lille genomstørrelse og enkle genetiske transformasjon2, gjør det mulig å fortsette som en mye brukt eksperimentell organisme. Arabidopsis kan imidlertid begrenses som modell for arter med ulike egenskaper eller unike egenskaper3. Dette har ført til utvikling av nye modellsystemer, som mais (Zea mays), en viktig plante for utviklingsgenetikk i monocots4, og tomat (Solanum lycopersicum), som er en viktig modell for evolusjonære studier, fruktutvikling og produksjon, og er en god representasjon for vegetabilske avlinger5. En metode for genetisk transformasjon er en forutsetning for at en planteart skal fungere som en modellorganisme2. En Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon er et pålitelig verktøy i plantebiologi; den har blitt brukt til å transformere noen få modellarter og store avlinger, inkludert tobakk (Nicotiana tabacum)6, ris (Oryza sativa)7, bomull (Gossypium hirsutum)8, soyabønner (Glycine max)9, potet (Solanum tuberosum)10 og raps (Brassica napus)11. Plantearter er svært variable i hvor vellykket de reagerer på A. tumefaciens-infeksjon, og transformasjonsprotokoller må ofte skreddersys individuelt for hver art 6,12.
Slekten Plantago omfatter totalt 256 plantearter, utbredt over hele verden13. Artene i denne slekten har ofte unike egenskaper som gjør dem ønskelige som modellarter for å studere genetikk, økologi, stressfysiologi, sekundære metabolitter, medisinsk kjemi, plantemikrobeinteraksjoner, planteutvikling og evolusjon. Plantago lanceolata, også kalt smalbladet eller ribwort plantain, har vært en populær plante av interesse siden det 19. århundre, da den først ble brukt til å beskrive fenomenet mannlig sterilitet14. Som andre planter i slekten har den blitt brukt i studier på tvers av ulike forskningsfelt. Mer nylig har det blitt foreslått som en modell for vaskulær biologi, da dets vaskulære vev lett kan samles15. P. lanceolata er den mest studerte arten i slekten Plantago; En artikkel fra 2021 rapporterte at det var >1.400 publikasjoner inkludert eller relatert til denne arten på den tiden16, og ytterligere 102 artikler er publisert siden begynnelsen av 2022, ifølge et PubMed-søk utført 9. Den nest mest studerte planten i slekten, P. major, er gjenstand for bare 414 artikler når den søkes etter de samme kriteriene på samme dato.
Til tross for forskningsinteressen for P. lanceolata, er studier, spesielt på genfunksjonskarakterisering, ofte begrenset av mangelen på en genetisk manipulasjonsverktøykasse for arten. Pommerrienig et al. gjorde en innsats for å utvikle en transformasjonsprotokoll for P. major ved hjelp av en blomsterdyppteknikk17. Denne metoden kan imidlertid ikke brukes på P. lanceolata på grunn av den mannlige steriliteten som er karakteristisk for denne arten18,19. Så vidt vi vet, er det ingen eksisterende protokoll for transformasjon av P. lanceolata.
Denne studien presenterer en enkel protokoll for A. tumefaciens-mediert transformasjon av P. lanceolata. Ved å målrette rotvev, kan fullvoksne transgene planter genereres innen 3 måneder etter transformasjon.
Mangelen på en transformasjonsprotokoll for planter i slekten Plantago begrenser bruken av disse plantene som modeller, spesielt når forskere er interessert i å utforske genfunksjoner. P. lanceolata ble valgt for å utvikle en genetisk transformasjonsprotokoll fordi den er den mest studerte planten i slekten16. Protokollen som er utviklet, vil sannsynligvis bli brukt som et verktøy for å fremme studier relatert til vaskulær biologi, økologi, plante-insekt-interaksjoner og abiotisk stressfysiologi.
Protokollen som presenteres skisserer tydelig trinn som tillater en bruker å skaffe transgene planter. Foruten P. lanceolatas evne til å trives i et vevskulturmiljø, bidro flere faktorer til suksessen til vår transformasjonsmetode. Først ble viktigheten av å bruke høy kvalitet, sterilt planterotvev for transformasjon observert. Røtter hadde de høyeste transformasjonsratene når de ble tatt fra 3-4 uker gamle planter, og virket grønne eller blekhvite. Røtter tatt fra bokser med en hvilken som helst mengde bakteriell eller soppforurensning resulterte ofte i forurensede skytekulturer, og eldre røtter som virket brune resulterte ikke i vellykket transformasjon. Rotvev var den mest effektive vevstypen for transformasjon med dagens metode, da blad- og petiolevev ikke lyktes med å utvikle skudd.
En annen viktig observasjon var at den optimale metoden for å samle rotvev for transformasjon var å plassere nykuttet rotmateriale i sterilt vann. Dette trinnet tillot effektivt rotmateriale å forbli hydrert mens resten av vevet ble samlet, da røtter har en tendens til å tørke ut raskt når de fjernes fra vekstbeholderne. Dette trinnet bidro også til å øke suksessraten for transformasjonen, fordi det tillot flere røtter å bli inkubert i bakteriene på en gang.
Denne protokollen kan endres ved å redusere tiden rotvevet inkuberer i samkulturmediet til 2 dager. Det ble observert at en 2 eller 3 dagers inkubasjonsperiode er tilstrekkelig til å tillate infeksjon som resulterer i skuddinitialer. Imidlertid anbefales ikke lengre inkubasjonstider, siden det ble observert at fraværet av en antibiotikainhibitor i media ofte resulterer i A. tumefaciens overvekst, noe som kan drepe det fremvoksende vevet.
En begrensning av denne studien er mangelen på tilgjengelige data om ytelsen til andre metoder eller arter av A. tumefaciens i P. lanceolata transformasjon for sammenligning. Så vidt vi vet er denne protokollen ny. Under de første forsøkene ble det observert en høy transformasjonseffektivitet med A. tumefaciens GV3101, og vi fokuserte på å raffinere teknikken ved hjelp av denne stammen i stedet for å eksperimentere med andre stammer. Vår transformasjonseffektivitet på 20% er relativt høy for anleggstransformasjon – mange konvensjonelle metoder anser alt >1% for å være vellykket26,27,28. Imidlertid kan bruk av en annen stamme av A. tumefaciens, som A. rhizogenes, kjent for bruk i rottransformasjon i flere arter 29,30,31, resultere i en enda høyere suksessrate. Ytterligere eksperimentering ville være nødvendig for å vurdere virkningen av å bruke andre stammer for å fremme økt transformasjonseffektivitet i P. lanceolata.
Den vellykkede transformasjonen av P. lanceolata vil trolig være til nytte for mange fagområder. Den høye transformasjonseffektiviteten, og den raske veksten av planten i vevskulturmedier, gjør P. lanceolata til en mulig kandidat for genfunksjonsstudier15.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 til CZ og YZ).
14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 | ThermoFisher Scientific | 150268 | |
1-Naphthylacetic acid | Gold Biotechnology | N-780 | |
3M Micropore Surgical Paper Tape | ThermoFisher Scientific | 19-027761 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Research Products International Corp. | 163227LC | |
600 Watt High Pressure Sodium Lights | Plantmax | PX-LU600 | |
6-Benzylaminopurine (6-BAP) | Gold Biotechnology | B-110 | |
Aluminum Foil | ThermoFisher Scientific | 01-213-100 | |
Bacto Agar | Thermofisher Scientific | 214010 | |
Binary Plasmid pBI101 | Clontech, USA | 632522 | |
Cool White Grow Light Sylvania LLC | Home Depot | 315952205 | |
D-biotin | ThermoFisher Scientific | BP232-1 | |
ddH2O | |||
DH5a E. coli | Invitrogen, USA | 18258012 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875714G | |
Dissecting Scissors | Leica Biosystems | 38DI12044 | |
Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705 | |
Folic Acid | Fisher Scientific | BP2519-5 | |
Forceps | Leica Biosystems | 38DI18031 | |
Gelrite | Research Products International Corp. | G35020-1000 | |
Glycerol | ThermoFisher Scientific | 17904 | |
Glycine | Sigma | 241261 | |
Incubated Tabletop Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | SHKE420HP | |
Indole-3-Acetic Acid (IAA) | Gold Biotechnology | I-110 | |
Indole-3-Butyric Acid (IBA) | Gold Biotechnology | I-180 | |
Kanamycin Monosulfate | Gold Biotechnology | K-120 | |
Macrocentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
Magenta Boxes | ThermoFisher Scientific | 50255176 | |
Micro Pipet Tips 1000 µL | Corning | 4140 | |
Micro Pipet Tips 200 µL | Corning | 4138 | |
Micro Pipette Tips 10 µL | Corning | 4135 | |
Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002410 | |
Micropipettor 0.5-10 µL | Corning | 4071 | |
Micropipettor 100-1000 µL | Corning | 4075 | |
Micropipettor 20-200 µL | Corning | 4074 | |
Micropipettor 2-20 µL | Corning | 4072 | |
Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins | PhytoTech | M519 | |
Murashige & Skooge Basal Salt Mixture | PhytoTech | M524 | |
myo-Inositol | Gold Biotechnology | I-25 | |
Nicotinic acid | Sigma | N0761-100g | |
Parafilm (paraffin film) | ThermoFisher Scientific | S37440 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Research Products International Corp. | P44000 | |
Pyridoxine HCl | Sigma | P6280-10g | |
Scalpel Blade Handle | Leica Biosystems | 38DI36419 | |
Scalpel Blades | Leica Biosystems | 3802181 | |
Sodium Chloride, Crystal (NaCl) | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Research Products International Corp. | S24000 | |
Sodium Hypochlorite | Walmart | 23263068401 | |
Soil- Bark Mix | Berger, USA | BM7 | |
Square Pots (3.5 inches squared) | Greenhouse Megastore | CN-TRK-1835 | |
Sucrose | Research Products International Corp. | S24060 | |
Thermocycler | ThermoFisher Scientific | A24811 | |
Thiamine HCl | Sigma | T4625-5G | |
Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) | Gold Biotechnology | T-104 | |
trans-Zeatin Riboside (ZR) | Gold Biotechnology | Z-100 | |
Tryptone | Thermofisher Scientific | 211705 | |
Wild Type Plantago lanceolata seeds | Outsidepride Seed Source, OR, USA | F1296 | Outsidepride.com |
Yeast Extract Granulated | Research Products International Corp. | Y20025-1000 |