Summary
Detta protokoll beskriver en effektiv metod för realtids- och dynamisk förvärv av spänningsstyrda kalium (Kv) kanalströmmar i H9c2-kardiomyocyter med hjälp av helcellspatchklämtekniken.
Abstract
Kaliumkanaler på myokardialcellmembranet spelar en viktig roll i regleringen av cellelektrofysiologiska aktiviteter. Som en av de viktigaste jonkanalerna är spänningsstyrda kaliumkanaler (Kv) nära förknippade med vissa allvarliga hjärtsjukdomar, såsom läkemedelsinducerad hjärtskada och hjärtinfarkt. I den aktuella studien användes helcellspatch-klämtekniken för att bestämma effekterna av 1,5 mM 4-aminopyridin (4-AP, en bredspektrum kaliumkanalhämmare) och akonitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM och 200 μM) på Kv-kanalströmmen (IKv) i H9c2-kardiomyocyter. Det visade sig att 4-AP hämmade I Kv med cirka 54%, medan den hämmande effekten av AC på IKv visade en dosberoende trend (ingen effekt för 25 μM, 30% hämmande hastighet för 50 μM, 46% hämmande hastighet för 100 μM och 54% hämmande hastighet för 200 μM). På grund av egenskaperna hos högre känslighet och precision kommer denna teknik att främja utforskningen av kardiotoxicitet och de farmakologiska effekterna av etnomedicin som riktar sig mot jonkanaler.
Introduction
Jonkanaler är speciella integrerade proteiner inbäddade i cellmembranets lipid-dubbelskikt. I närvaro av aktivatorer bildar centra av sådana speciella integrerade proteiner mycket selektiva hydrofila porer, vilket gör att joner av lämplig storlek och laddning kan passera igenom på ett passivt transportsätt1. Jonkanaler är grunden för cellens excitabilitet och bioelektricitet och spelar en nyckelroll i en mängd olika cellulära aktiviteter2. Hjärtat levererar blod till andra organ genom regelbundna sammandragningar till följd av en excitation-sammandragningskopplad process initierad av åtgärdspotentialer3. Tidigare studier har bekräftat att genereringen av åtgärdspotentialer i kardiomyocyter orsakas av förändringen i intracellulär jonkoncentration, och aktiveringen och inaktiveringen av Na+, Ca2+ och K+ jonkanaler i humana kardiomyocyter leder till bildandet av åtgärdspotentialer i en viss sekvens 4,5,6. Störda spänningsstyrda kalium (Kv) kanalströmmar (IKv) kan förändra den normala hjärtrytmen, vilket leder till arytmier, som är en av de främsta dödsorsakerna. Därför är inspelning av IKv avgörande för att förstå mekanismerna för läkemedel för behandling av livshotande arytmier7.
Kv-kanalen är en viktig komponent i kaliumkanalen. Kv-kanalens koordinationsfunktion spelar en viktig roll i den elektriska aktiviteten och myokardiella kontraktiliteten hos däggdjurshjärtat 8,9,10. I kardiomyocyter beror amplituden och varaktigheten av åtgärdspotentialer på samledningen av utåtriktade K + -strömmar med flera Kv-kanalsubtyper11. Regleringen av Kv-kanalfunktionen är mycket viktig för den normala repolariseringen av hjärtåtgärdspotentialen. Även den minsta förändringen i Kv-konduktans påverkar kraftigt hjärtrepolarisering och ökar risken för arytmi12,13.
Som representant för en grundläggande metod inom cellulär elektrofysiologisk forskning kan en tätning med hög resistans mellan ett litet område av cellmembranet och en pipettspets för inspelning av helcellspatchklämma fastställas genom att applicera ett undertryck. Det kontinuerliga undertrycket gör att cellmembranet kommer i kontakt med pipettspetsen och fastnar på pipettens innervägg. Den resulterande kompletta elektriska kretsen gör att man kan registrera vilken enskild jonkanalström som helst över cellmembranets yta14. Denna teknik har en mycket hög känslighet för cellmembranets jonkanalström och kan användas för att detektera strömmar i alla jonkanaler, och applikationerna är extremt breda15. Dessutom, jämfört med fluorescerande märkning och radioaktiv märkning, har patch-clamp högre auktoritet och noggrannhet16. För närvarande har helcellspatch-clamp-tekniken använts för att detektera de traditionella kinesiska medicinkomponenterna som verkar på Kv-kanalströmmar17,18,19. använde till exempel helcellspatchklämtekniken och bekräftade att den effektiva komponenten i lotusfröet kan uppnå hämningen av Kv4.3-kanalen genom att blockera de aktiverade tillståndskanalerna19. Akonitin (AC) är en av de effektiva och aktiva ingredienserna i Aconitum-arter, såsom Aconitum carmichaeli Debx och Aconitum pendel Busch. Många studier har visat att överdoser av AC kan orsaka arytmier och till och med hjärtstillestånd20. Samspelet mellan växelström och spänningsstyrda jonkanaler leder till störning av intracellulär jonhomeostas, vilket är nyckelmekanismen för kardiotoxicitet21. Därför används i denna studie helcellens patch-klämteknik för att bestämma effekterna av AC på IKv av kardiomyocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De kommersiellt erhållna H9c2-råttkardiomyocyterna (se materialtabellen) inkuberades i DMEM innehållande 10% värmeinaktiverat fosterserum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° C i en 5%CO2 fuktad atmosfär. Helcellspatch-klämtekniken användes sedan för att detektera förändringarna i IKv i normala H9c2-celler och 4-AP- eller AC-behandlade celler (figur 1 och figur 2).
1. Beredning av lösningen
- Förbered DMEM-cellodlingsmediet som innehåller 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin (se materialförteckning).
- Bered 1,5 M 4-AP-lösning genom att tillsätta 14,1165 mg 4-AP till 100 μl DMSO-lösning (se materialtabell). Späd 1,5 M 4-AP till 1,5 mM genom att tillsätta den extracellulära lösningen (steg 1.5).
- Bered 400 mM AC genom att tillsätta 5 mg AC till 19,36 μL DMSO-lösning (se Materialförteckning).
OBS: Alla ovanstående lösningar förvarades i kylskåp vid 4 °C och den slutliga koncentrationen av DMSO får inte överstiga 0,1 % (v/v). - Bered 50 ml intracellulär lösning genom att tillsätta 0,4100 g KCl (110,0 mM), 0,0120 g MgCl2 (1,2 mM), 0,1270 g Na2 ATP (5,0 mM), 0,1190 g HEPES (10,0 mM) och 0,1900 g EGTA (10,0 mM) i 50 ml dubbeldestilleratvatten (se tabell 1 och materialtabell).
OBS: pH-värdet för den intracellulära lösningen justerades till 7,2 med användning av 1 M KOH och alikvoterades i små volymer (1,5-2 ml) och lagrades vid −20 °C. - Bered 50 ml extracellulär lösning genom att tillsätta 0,0185 g KCl (5,0 mM), 0,3945 g NaCl (135,0 mM), 0,0203 g MgCl 2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g HEPES (5,0 mM) och 0,0990 g D-glukos (10,0 mM) till 50 ml dubbeldestillerat vatten (se tabell 1 och materialtabell).
OBS: Den extracellulära lösningen måste beredas för omedelbar användning, och dess pH-värde måste justeras till 7,4 med hjälp av 1 M NaOH.
2. Cellodling
- När H9c2-odlingsskålen blir 80% sammanflytande, smälta cellerna med 0,25% trypsin i 30 s.
- Odla 2 x 10 5 celler/ml med normalt medium eller läkemedelsinnehållande medium (25 μM, 50 μM, 100 μM och 200 μM AC) i en 35 mm skål heltäckningsmatta med glasplattor i 24 timmar vid 37 °C, med en5% CO2-atmosfär och 70% till 80% relativ fuktighet (se materialtabell).
3. Tillverkning av mikropipetter
- Slå på mikropipettdragaren (se Materialförteckning) och förvärm i 30 minuter.
- Sätt en borosilikatglaskapillär med en glödtråd (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm längd) på mikropipettdragaren. Välj programuppsättningen i steg 3.3 och klicka på Enter på kontrollpanelen. Klicka på rampprogrammet i det övre högra hörnet för att bestämma "Heat" -värdet på glaskapillären.
- Skriv programmet för att dra elektroden enligt det värde som bestäms av "Ramp" -testet och använd följande steg: "Värme" -värde = "Ramp" -värde, Pull = 0, Vel = dragstångens rörelsehastighet, Tid = 200-250. Klicka på Pull för att börja tillverka pipetterna.
OBS: Observera färgen på torkmedlen i den förseglade behållaren på mikropipettdragaren innan du använder den. Om färgen ändras från blått till rosa måste torkmedlen bytas ut. För att förhindra förorening av elektrodspetsen, försök att inte röra vid den mellersta delen av glaskapillären under pipettberedningen. Ta sedan försiktigt bort de producerade pipetterna och placera dem i en sluten och förseglad behållare.
4. Inställning av instrument
- Slå på motsvarande instrument i följande ordning: den digitala analogomvandlaren, signalförstärkaren, mikromanipulatorn, mikroskopet och kameran (se materialförteckning).
- Öppna bildbehandlingsprogrammet, signalförstärkarprogramvaran och datainsamlingsprogrammet i följd (se materialförteckning).
OBS: Instrumentet måste slås på sekventiellt; annars visas tillståndet "Demo Digitizer" efter att programvaran har öppnats.
5. IKv parameterinställning
- Redigera protokollet för inspelning av IKv enligt stegen nedan.
- Klicka på Redigera och välj Redigera protokoll i datainsamlingsprogrammet (se Materialförteckning).
- Redigera programmet i gränssnittet "Waveform": Epoch A (Första nivån = −60 mV, Deltanivå = 0 mV, Första varaktigheten = 20 ms och Deltalängden = 0 ms); Epoch B (Första nivån = −40 mV, Deltanivå = 10 mV, Första varaktighet = 150 ms och Deltavaraktighet = 0 ms) och Epoch C (Första nivån = −60 mV, Deltanivå = 0 mV, Första varaktighet = 30 ms och Deltavaraktighet = 0 ms).
- Klicka sedan på gränssnittet Mode / Rate och ställ in "Trial Hierarchy" -data: Trial delay = 0 s, Runs = 1, Sweeps = 11 och Sweep duration = 0.22 s22,23.
OBS: Förvärva I Kv-kanalströmmarna genom att applicera 150 ms depolariserande steg från −40 mV till +60 mV med en ökning av 10 mV vid en hållpotential på −60 mV under kontrollförhållanden. Den totala tiden för protokollet måste vara större än den tid som ställts in i programmet "Waveform".
- Redigera P/N Leak Subtraction-programmet: klicka på Edit Protocol för att välja Stimulus-knappen och ställ in läckagesubtraktionsprogrammet i dialogrutan P/N Leak Subtraktion : antal Subsweeps = 2-8 (4 i denna studie), Sedimenteringstid = 100-1 000 ms (200 i denna studie), "Polaritet" = "Motsatt vågform", hållnivå = −80 mV.
OBS: P/N-läckagesubtraktionen måste ha en hållnivå som är lägre än "First holding" (−60 mV).
6. Helcellspatchkläminspelning av I Kv i spänningsklämläge
- Upprätta datalagringsvägen: klicka på Arkiv och välj Ange datafilnamn i datainsamlingsprogramvaran. Öppna det etablerade IKv-protokollet (steg 5.1) genom att välja Redigera och klicka på Open Protocol i datainsamlingsprogrammet. Klicka slutligen på alternativet Verktyg och välj Membrantest för att börja köra protokollet.
- Tillsätt den extracellulära lösningen (steg 1.5) i cellbadet på helcellspatchklämman (se materialförteckning) och placera täckglaset uppåt med H9c2-cellerna (odlade i steg 2.1) i badet.
- Fyll 30% av pipetten (tillverkad i steg 3) med den extracellulära lösningen och installera den på inspelningselektrodhållaren integrerad i patch-klämapparaten. Dra åt pipetten med o-ringgummipackningen och plastbrickan. Släpp sedan pipetten i badet med mikromanipulatorn. Klicka på pipettförskjutningsgränssnittet för signalförstärkarprogramvaran (se materialförteckning) för att bibehålla I Kv-strömbaslinjen vid 0 pA.
OBS: Den intracellulära lösningen (steg 1.4) måste vara i kontakt med AgCl/Ag-delen av silvertråden och silvertråden får inte vara nära pipettens innervägg. Pipettens motstånd måste vara 2-6 MΩ. För att undvika ocklusion av pipettspetsen måste ett kontinuerligt övertryck tillföras pipetten med en 1,0 ml spruta ansluten till inspelningselektrodhållaren via plaströr24. - Leverera ett lämpligt övertryck manuellt med en 1,0 ml spruta ansluten till inspelningselektrodhållaren genom ett plaströr. Flytta pipetten något genom att manipulera mikromanipulatorn i tre dimensioner för att komma i kontakt med cellen.
- När membrantestet kvadratvågen sjunker med 1/3 till 1/2 efter att pipetten vidrör cellmembranet, ta bort det positiva trycket och manuellt leverera ett lämpligt undertryck. Klicka sedan på Patch-gränssnittet för datainsamlingsprogramvaran för att bilda GΩ-tätningen. Använd signalförstärkarprogramvaran "Cp Fast" och "Cp Slow" under celltätning för att kompensera för den snabba och långsamma kapacitansen.
OBS: När membrantestet är ≥1 GΩ bildas en cellbunden konfiguration mellan pipettspetsen och cellen. - Applicera korta pulser av undertryck för att brista en lapp av cellmembranet.
OBS: En kraftig minskning av membranmotståndet kännetecknar ett framgångsrikt helcellsregistreringsmönster. Om åtkomstmotståndet (Ra) ≥30 MΩ måste cellerna väljas på nytt för steg 6.3-6.6. För att säkerställa noggrannheten hos de registrerade IKv-data måste undertrycket avlägsnas efter att cellmembranet har brutits. - Utför helcellsmembrankapacitanskompensation genom att klicka på helcellsknappen i signalförstärkarprogramvaran. Slutligen spara och spela in data genom att klicka på Datainspelning knapp.
- Öppna de sparade IKv-data med dataanalysprogramvaran. Spara sambanden strömspänning (I−V): klicka på Analysera för att välja Statistik för att göra följande: välj intervallet som Cousors 1,2 för dataanalys; klicka på knapparna Peak Amplitude och Mean och klicka sedan på OK för att visa data på sidan Resultat. Slutligen, kopiera kolumnen i I Kv-medeldata till funktionsritningsprogrammet (se Materialförteckning) för vidare analys.
- Spara representanten IKv aktuella spår: klicka på Redigera för att välja Överför spår; välj sedan fullständig spårning i regionen som ska överföras; klicka sedan på Välj i spårval och välj IN 0 (pA) i Signaler; slutligen klickar du på OK för att visa data på sidan "Resultat" och kopiera den totala informationen till funktionsritningsprogrammet för att rita de aktuella spåren.
- Spara IKv-protokollet : klicka på Redigera för att välja Skapa stimulansvågformssignal och välj OK. Gör sedan om steg 6.9 förutom att välja A0 # 0 (mA) i "Signaler".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll tillät inspelning av IKv enligt de parametrar som ställts in i helcellens patch-clamp-teknik. IKv utlöstes av 150 ms depolariserande pulsstimulans från −40 till +60 mV vid en hållpotential på −60 mV (figur 3A). IKv av H9c2-råttkardiomyocyterna uppträdde först runt -20 mV, och sedan ökade amplituden med ytterligare depolarisering. Det genomsnittliga förhållandet mellan IKv och membranpotentialen beräknades utifrån de uppmätta strömamplituderna. Resultaten visade att i jämförelse med kontrollgruppen minskade I Kv-amplituden observerbart efter 5 minuters behandling med 1,5 mM 4-AP (figur 3B). Dessutom minskade IKv signifikant vid membranpotentialer från 10 mV till 60 mV på ett dosberoende sätt efter 24 h AC-behandling (figur 3C-F).
Figur 1: Utrustning och instrument som krävs för att spela in IKv. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Flödesschema över den elektrofysiologiska registreringen av IKv i H9c2-celler med hjälp av en helcellspatch-klämteknik. (A) Cellodling. B) Beredning av intracellulära och extracellulära lösningar. (C) Schematisk illustration av helcellsinspelning. C1: Flytta pipetten nära cellen; C2: Bilda en tätning med högt motstånd mellan pipetten och cellen; C3: Brista cellmembranet. d) registrera IKv. D1: Schematiskt diagram över K + strömbildning; D2: Representativa strömspår för IKv registrerade i helcellsspänningsklämläge. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativ IKv i H9c2-celler. (A) Representativa strömspår för IKv uppmätta i H9c2-celler utan behandling (kontrollgrupp), med AC-innehållande medier i 24 timmar (25 μM, 50 μM, 100 μM och 200 μM) och med 1,5 mM 4-AP i 5 min. IKv utlöstes av 150 ms depolariserande puls från −40 till +60 mV vid en hållpotential på −60 mV. (B) För 1,5 mM 4-AP-stimulering sjönk IKv vid membranpotentialer från 10 mV till 60 mV. (C-F) AC-behandling minskade IKv på ett koncentrationsberoende sätt vid membranpotentialer från 10 mV till 60 mV. *p < 0,05 mot kontrollgruppen (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Extracellulär lösning | ||
| Kemikalier | g/50 ml | Sammansättning (mM) |
| NaCl | 0.3945 | 135.0 |
| KCl | 0.1865 | 5.0 |
| HEPES | 0.5958 | 5.0 |
| MgCl 2·6H2O | 0.2033 | 2.0 |
| D-glukos | 0.9900 | 10.0 |
| Intracellulär lösning | ||
| Kemikalier | g/50 ml | Sammansättning (mM) |
| KCl | 0.4100 | 110.0 |
| MgCl2 | 0.0120 | 1.2 |
| Na2-ATP | 0.1270 | 5.0 |
| HEPES | 0.1190 | 10.0 |
| EGTA | 0.1900 | 10.0 |
Tabell 1: Intracellulära och extracellulära lösningar för inspelning av IKv i spänningsklämläge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den elektrofysiologiska tekniken med lappklämma används huvudsakligen för att registrera och återspegla jonkanalernas elektriska aktivitet och funktionella egenskaper på cellmembranet25. För närvarande inkluderar de viktigaste inspelningsmetoderna för patch-clamp-tekniken enkanalsinspelning och helcellsinspelning26. För helcellsläget används glasmikroelektroden och undertrycket för att bilda en tätning med hög resistans mellan ett litet område av cellmembranet och en pipettspets27. När det ihållande undertrycket får pipettens spets att brista cellmembranet och membranet fäster vid pipettens innervägg, möjliggör den kompletta elektriska kretsen som bildas mellan pipetten och cellen att registrera strömtätheten för enskilda jonkanaler på cellmembranytan26,27 . Under de senaste åren har helcellspatch-clamp-tekniken använts i stor utsträckning för läkemedelsforskning riktad mot jonkanalrelaterade sjukdomar. Även om den har höga krav på operatörer, är denna teknik fortfarande "guldstandarden" för jonkanalforskning28. Dessutom kan den perforerade patch-clamp-tekniken också registrera de aktuella förändringarna i måljonkanaler i relativt stabila intracellulära miljöer under längre varaktigheter genom att använda antibiotika för att bilda permeabilitetsporer i cellmembranet 29,30. Man kan registrera och spåra de dynamiska förändringarna i spänningen eller strömmen hos jonkanaler med hjälp av helcellspatch-klämtekniken i strömklämman eller spänningsklämläge, vilket gör detta utan tvekan till en kraftfull plattform för att utvärdera den farmakologiska aktiviteten eller toxicitetsmekanismerna för läkemedel31,32.
AC är en av de viktigaste toxiska komponenterna i Aconitum-arter, tillhör gruppen diester-diterpenoidalkaloider och är mycket giftig20,33. Bevis har visat att AC kan orsaka kardiovaskulär toxicitet34,35. Som en icke-selektiv K + kanalblockerare har det rapporterats att AC kan blockera den övergående yttre K + -strömmen, ultrasnabb fördröjd likriktare K + -ström och snabb fördröjd likriktare utåt K + -ström, vilket inducerar arytmier21,36,37. Hittills finns det inga starka bevis för att spänningsberoende kaliumströmmar är involverade i hjärttoxiciteten hos AC. Därför undersöktes i denna studie den hämmande effekten av AC på IKv hos råtta H9c2-kardiomyocyter med hjälp av helcellspatchklämtekniken. Aktiveringen av Na+ -kanaler är en allmänt erkänd mekanism genom vilken AC utövar farmakologiska eller toxikologiska effekter38. Intressant nog finns det bevis för att AC kan agera direkt på IKv 21,36,37. De data som presenteras i detta dokument ger dock inte tillräckliga bevis för att AC direkt kan hämma IKv. Den IKv-hämmande effekten av AC kan bero på direkt aktivering av Na + -kanaler, vilket kräver ytterligare undersökning.
Sedan starten och utvecklingen har helcellens patch-clamp-teknik som används i denna studie blivit en konventionell metod för att utforska läkemedlets kardiotoxicitet när det gäller jonkanaler. Detta experiment bekräftade att AC effektivt hämmade IKv av H9c2-celler på ett koncentrationsberoende sätt i spänningsklämläge. Varje typ av jonkanal, inklusive K + -kanaler, innehåller emellertid flera undertyper, och endast den totala spänningsberoende K + -kanalströmmen registrerades i denna studie. Efterföljande studier kan utforska de farmakologiska och toxikologiska mekanismerna för AC med hjälp av modellcellinjer med ett högt uttryck av specifika jonkanalsubtyper37. Alternativt kan man införliva specifika jonkanaler märkta med fluorescerande proteiner för att undersöka myokardiell toxicitet hos AC visuellt39. De kritiska stegen i detta protokoll är steg 6.4-6.6; Genom att slutföra dessa tre steg avgörs direkt om den efterföljande inspelningen av IKv lyckas. Jämfört med andra tekniker är helcellspatchklämtekniken guldstandarden och den accepterade metoden för att registrera strömmen i enstaka jonkanaler i cellmembranet eller organellmembranet, med egenskaperna hos höga tekniska krav och inspelning med låg genomströmning40. Sammanfattningsvis är denna teknik inte bara en grundläggande metod för cellelektrofysiologisk forskning utan används också i stor utsträckning inom neurovetenskap, kardiovaskulär vetenskap och andra områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi uppskattar det ekonomiska stödet från National Natural Science Foundation of China (82130113) och Key R&D and Transformation Program för Science & Technology Department of Qinghai-provinsen (2020-SF-C33).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
| Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
| Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
| Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
| Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
| D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
| Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
| Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
| H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
| KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
| KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
| MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
| MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
| Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
| Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
References
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
- Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
- Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
- Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
- Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
- Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
- Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
- Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
- Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
- Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
- Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).
- Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
- Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
- Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
- Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
- Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
- Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
- Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
- Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
- An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
- Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
- Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
- Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
- Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
- Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
- Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
- Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
- Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
- Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
- Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
- Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
- Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).
- Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
- Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
- Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
- Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).
