Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Sondering av RNA-struktur med dimetylsulfatmutasjonsprofilering med sekvensering in vitro og i celler

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64820
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Harvard Medical School

Summary

Protokollen gir instruksjon for modifisering av RNA med dimetylsulfat for mutasjonsprofileringseksperimenter. Det inkluderer in vitro og in vivo sondering med to alternative biblioteksforberedelsesmetoder.

Abstract

Rollen til RNA-struktur i nesten hvilken som helst biologisk prosess har blitt stadig tydeligere, spesielt i det siste tiåret. Imidlertid har klassiske tilnærminger til å løse RNA-struktur, som RNA-krystallografi eller kryo-EM, ikke klart å holde tritt med det raskt utviklende feltet og behovet for løsninger med høy gjennomstrømning. Mutasjonsprofilering med sekvensering ved bruk av dimetylsulfat (DMS) MaPseq er en sekvenseringsbasert tilnærming for å utlede RNA-strukturen fra en bases reaktivitet med DMS. DMS metylerer N1-nitrogenet i adenosiner og N3 i cytosiner ved Watson-Crick-ansiktet når basen er uparret. Revers-transkribering av det modifiserte RNA med termostabil gruppe II intron revers transkriptase (TGIRT-III) fører til at de metylerte basene blir innlemmet som mutasjoner i cDNA. Ved sekvensering av det resulterende cDNA og kartlegging av det tilbake til et referansetranskripsjon, er de relative mutasjonsratene for hver base indikativ for basens "status" som parret eller ikke-paret. Selv om DMS-reaktiviteter har et høyt signal-til-støy-forhold både in vitro og i celler, er denne metoden følsom for skjevheter i håndteringsprosedyrene. For å redusere denne skjevheten, gir dette papiret en protokoll for RNA-behandling med DMS i celler og med in vitro transkribert RNA.

Introduction

Siden oppdagelsen av at RNA har både strukturelle1,2 og katalytiske3 egenskaper, har betydningen av RNA og dets regulatoriske funksjon i en mengde biologiske prosesser blitt gradvis avdekket. Faktisk har effekten av RNA-struktur på genregulering fått økende oppmerksomhet4. Som proteiner har RNA primære, sekundære og tertiære strukturer, med henvisning til sekvensen av nukleotider, 2D-kartleggingen av base-pairing-interaksjoner og 3D-foldingen av disse baseparrede strukturer, henholdsvis. Mens bestemmelse av tertiær struktur er nøkkelen til å forstå de eksakte mekanismene bak RNA-avhengige prosesser, er den sekundære strukturen også svært informativ om RNA-funksjon og er grunnlaget for videre 3D-folding5.

Imidlertid har det vært iboende utfordrende å bestemme RNA-strukturen med konvensjonelle tilnærminger. Mens for proteiner har krystallografi, kjernemagnetisk resonans (NMR) og kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) gjort det mulig å bestemme mangfoldet av strukturelle motiver, noe som muliggjør strukturprediksjon fra sekvensen alene6, er disse tilnærmingene ikke allment anvendelige for RNA. Faktisk er RNA fleksible molekyler med byggesteiner (nukleotider) som har mye mer konformasjons- og rotasjonsfrihet i forhold til deres aminosyre-kolleger. Videre er interaksjonene gjennom base-sammenkobling mer dynamiske og allsidige enn de av aminosyrerester. Som et resultat har klassiske tilnærminger bare vært vellykkede for relativt små RNA med veldefinerte, svært kompakte strukturer7.

En annen tilnærming for å bestemme RNA-strukturen er gjennom kjemisk sondering kombinert med neste generasjons sekvensering (NGS). Denne strategien genererer informasjon om bindingsstatusen til hver base i en RNA-sekvens (dvs. dens sekundære struktur). Kort sagt, basene i et RNA-molekyl som ikke engasjerer seg i baseparing, er differensielt modifisert av små kjemiske forbindelser. Revers-transkribering av disse RNA-ene med spesialiserte reverstranskriptaser (RTs) inkorporerer modifikasjonene i komplementær deoksyribonukleinsyre (cDNA) som mutasjoner. Disse cDNA-molekylene blir deretter forsterket av polymerasekjedereaksjonen (PCR) og sekvensert. For å få informasjon om deres "status" som bundet eller ubundet, beregnes mutasjonsfrekvensene ved hver base i et RNA av interesse og legges inn i strukturprediksjonsprogramvare som begrensninger8. Basert på nærmeste nabo regler9 og minimum gratis energiberegninger 10, genererer denne programvaren strukturmodeller som passer best til de oppnådde eksperimentelle dataene11,12.

DMS-MaPseq bruker DMS, som metylerer N1-nitrogenet i adenosiner og N3-nitrogen i cytosiner ved Watson-Crick-ansiktet på en svært spesifikk måte13. Bruk av termostabil gruppe II intron revers transkriptase (TGIRT-III) i revers transkripsjon skaper mutasjonsprofiler med enestående signal-til-støy-forhold, og tillater til og med dekonvolusjon av overlappende profiler generert av to eller flere alternative konformasjoner14,15. Videre kan DMS trenge inn i cellemembraner og hele vev, noe som gjør sondering innenfor fysiologiske sammenhenger mulig. Generering av data av god kvalitet er imidlertid utfordrende, da variasjoner i håndteringsprosedyren kan påvirke resultatene. Derfor gir vi en detaljert protokoll for både in vitro og in-cell DMS-MaPseq for å redusere skjevhet og veilede nykommere til metoden gjennom vanskelighetene de kan støte på. Spesielt i lys av den nylige SARS-CoV2-pandemien er data av høy kvalitet om RNA-virus et viktig verktøy for å studere genuttrykk og finne mulige terapier.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, programvare, reagenser, instrumenter og celler som brukes i denne protokollen.

1. Genspesifikk in vitro DMS-MaP

  1. RNA in vitro transkripsjon
    1. Få sekvensen av RNA av interesse som dobbeltstrenget (ds) DNA (f.eks. Som DNA-fragmenter, plasmider eller PCR fra eksisterende / genomisk DNA). Hvis DNA-sekvensen inneholder en polymerasepromotor, hopper du til trinn 3.
    2. Utfør overlapping PCR for å feste en RNA-polymerasepromotor oppstrøms for det ønskede DNA-fragmentet (fremoverprimer for T7-polymerase: 5' TAATACGACTCACTATAGG + første baser av målsekvens 3').
    3. In vitro transkriberer DNA-fragmentet til RNA. Hold alltid RNA på is.
    4. Fordøye DNA ved hjelp av en DNase.
    5. Isoler RNA ved hjelp av en kolonnebasert tilnærming (trinn 2.4) eller ved etanolutfelling (trinn 2.5). Elute i et passende volum, forventer et utbytte på ~ 50 μg.
    6. Sikre RNA-integriteten ved å kjøre den på en agarosegel; denaturere RNA i 2-3 min ved 70 °C før du løper.
      MERK: Bufferen og agarose kan inneholde RNaser som nedbryter RNA og kan forurense RNA-prøven. Prefabrikkerte agarosegeler har tidligere blitt brukt i dette laboratoriet; resultatene (spesielt med RNA) har til tider vært tvetydige. De beste resultatene ble oppnådd med agarose eller PAGE geler.
    7. Direkte bruk av lagre RNA ved -80 ° C i flere måneder med mindre nedbrytning er synlig etter tining.
  2. In vitro DMS modifikasjon (ved 105 mM DMS)
    1. Forbered en tilstrekkelig mengde refolding buffer (0,4 M natrium cacodylate, pH 7,2, inneholdende 6 mM MgCl2).
      MERK: For hver reaksjon (endelig volum på 100 μL), tilsett 89 μL av refolding buffer.
    2. For hver reaksjon, overfør 89 μL av refolding buffer til en utpekt 1,5 ml rør, og forvarm ved 37 ° C i en thermoshaker plassert under en kjemisk hette.
      MERK: DMS er svært giftig og må alltid holdes under en kjemisk hette til den slukkes av et reduksjonsmiddel.
    3. Elute 1-10 pmol av RNA i 10 μL nukleasefritt vann (NF H2O); overføring til et PCR-rør.
    4. Inkuber i en termocykler ved 95 ° C i 1 minutter for å denaturere RNA.
    5. Plasser på en isblokk umiddelbart for å unngå feilfolding.
    6. Legg RNA-prøven til det angitte røret med refolding buffer ved 37 ° C, bland godt og inkuber i 10-20 minutter for å brette RNA på nytt.
      MERK: De fleste RNA vil foldes i størrelsesorden millisekunder til sekunder, selv om unntak eksisterer16.
    7. Tilsett 1 μL 100% (10,5 M) DMS til RNA-prøven, og inkuber i 5 minutter mens du rister ved 800-1,400 rotasjoner per minutt (rpm).
      MERK: Risting (eller andre former for blanding) på dette trinnet er avgjørende, da DMS er hydrofob og kanskje ikke oppløses helt i omfoldingsbufferen. Avvik i reaksjonstider kan påvirke reproduserbarheten av DMS-reaktivitetene. For å minimere pipetteringsfeil kan DMS oppløses i 100% etanol før den tilsettes prøven hvis en endelig konsentrasjon på 1% (105 mM) DMS opprettholdes. For en ubehandlet kontroll kan DMS erstattes av dimetylsulfoksid (DMSO) eller vann.
    8. Etter 5 minutters reaksjonstid, slukk med 60 μL 100% β-merkaptoetanol (BME), bland godt og legg RNA umiddelbart på is.
      MERK: RNA kan trygt fjernes fra hetten etter å ha slukket reaksjonen med BME for å rydde den opp. Imidlertid bør direkte eksponering av BME til omgivelsene fortsatt unngås på grunn av sin sterke lukt og irriterende egenskaper.
    9. Rydd opp RNA ved natriumacetat-etanolutfelling (se trinn 2.5) eller en kolonnebasert tilnærming (se trinn 2.6), og eluer i 10 μL vann.
    10. Kvantifiser RNA ved hjelp av et spektrofotometer.
    11. Direkte bruk av lagre det modifiserte RNA ved -80 ° C.
      MERK: Langtidslagring bør unngås, da RNA er mindre stabilt etter DMS-behandling.
  3. Genspesifikk RT-PCR av modifisert RNA
    MERK: Se figur 1 for RT-PCR-oppsettet av DMS-behandlede fragmenter.
    1. Elute 100 ng modifisert RNA i 10 μL nukleasefri (NF) H2O. Overføring til et PCR-rør.
    2. Til røret tilsettes 4 μL 5x første trådbuffer (FSB), 1 μL dNTP-blanding (10 mM hver), 1 μL 0,1 M dithiothreitol (DTT) (unngå fryse-tine-sykluser), 1 μL RNase-hemmer, 1 μL 10 μM omvendt primer (enkeltprimer eller et basseng av primere) og 1 μL TGIRT III.
      MERK: For et basseng med primere, ikke tilsett 1 μL av 10 μM av hver primer direkte til RT; Bland i stedet primerne først, og tilsett 1 μL fra blandingen (ved 10 μM total primerkonsentrasjon).
    3. Inkuber ved 57 ° C i 30 minutter til 1,5 timer (vanligvis er 30 minutter tilstrekkelig til å lage et 500 nt produkt) i en termocykler.
    4. Tilsett 1 μL 4 M NaOH, bland ved pipettering og inkuber ved 95 °C i 3 minutter for å nedbryte RNA.
      MERK: Dette trinnet er avgjørende da det frigjør TGIRT fra cDNA ved å nedbryte RNA. Hvis hoppet over, kan nedstrøms PCR bli påvirket.
    5. Rydd opp ved hjelp av en kolonnebasert tilnærming (se trinn 2.6) som fjerner primerne tilstrekkelig, og eluer i 10 μL NF H2O.
    6. PCR-forsterk cDNA ved å bruke 1 μL av revers transkripsjonsprodukt per 25 μL av reaksjonen med et PCR-sett designet for å balansere utbytte og troskap.
      MERK: Primerne skal ha en smeltetemperatur på ~60 °C.
    7. Kjør 2 μL av PCR-produktet på en agarosegel eller en prefabrikkert agarosegel for å bekrefte PCR-suksessen.
    8. Ideelt sett bør bare ett bånd vises etter PCR. I så fall må du rydde opp i reaksjonen ved hjelp av en kolonnebasert tilnærming. Hvis alternative bånd er tilstede, bruk den gjenværende PCR-reaksjonen for å fjerne riktig bånd fra gelen. Elute i et tilstrekkelig lite volum (f.eks. 10 μL).
    9. Kvantifiser de ekstraherte fragmentene ved hjelp av et spektrofotometer.
    10. Indekser dsDNA-fragmentene for sekvensering ved hjelp av en tilnærming som passer til ønsket sekvenseringsplattform.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt oppsett for RT-PCR av store DMS-behandlede fragmenter. Når du utfører revers transkripsjon på et modifisert RNA, vil modifikasjonene på sekvensen som primer anneals til ikke bli registrert. Således, når fragmentene overstiger 400-500 bp i lengde, må fragmenter som overlapper i primerområdene utformes, som eksemplifisert her. Lengden på fragmentene avhenger av sekvenseringsbehovene. Ved bruk av parret 150-syklussekvensering bør fragmentene ikke overstige 300 bp. Forkortelser: RT-PCR = revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon; DMS = dimetylsulfat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Helgenom DMS-MaP ved bruk av virusinfiserte celler

MERK: I celler kan DMS-behandling også kombineres med den genspesifikke forsterkningsmetoden beskrevet ovenfor. Hele genombiblioteket krever enorm sekvenseringsdybde for å oppnå full dekning på et enkelt gen. Imidlertid, hvis virale RNA utgjør en betydelig del av det ribodepleted RNA etter ekstraksjon, vil helgenomsekvensering være hensiktsmessig. Videre kan andre anrikningsmetoder kombineres med helgenombibliotekgenereringsmetoden.

  1. DMS-behandling
    1. Vokse celler infisert med viruset til ønsket stadium av infeksjon.
    2. Overfør cellebeholderen til en dedikert avtrekksvifte som er egnet for håndtering av både virus på det nødvendige biosikkerhetsnivået og de kjemiske røykene som genereres av agenter som DMS.
    3. Tilsett et 2,5% volum DMS til kulturmediet, og forsegl beholderen (vanligvis en 10 cm plate) med parafilm.
      MERK: Det er enkelt å under-modifisere og over-modifisere med DMS. Når du legger DMS direkte til celler, er det svært viktig å blande godt. Alternativt kan du forvarme det nye mediet i et 50 ml konisk rør ved 37 °C, og tilsette DMS direkte risting kraftig. Dekantere det brukte mediet på cellene, og pipetter sakte i det DMS-holdige mediet.
    4. Overfør til en 37 °C inkubator i 5 min.
      MERK: Avhengig av hvor lang tid det tar å håndtere DMS utenfor inkubatoren, er det mulig at 5 minutter vil føre til overmodifisering. Hold tiden fra å legge til DMS til inkubering til ≤1 min. Hvis du utfører eksperimentet for første gang, anbefales det å gjøre en DMS-titrering og variere inkubasjonstiden (mellom 3 minutter og 10 minutter) for å finne den optimale modifikasjonshastigheten og sikre at resultatene er robuste over et konsentrasjonsvindu.
    5. Piplegg forsiktig ut det DMS-holdige mediet (i passende kjemisk avfall) og tilsett forsiktig 10 ml stoppbuffer (PBS med 30% BME [f.eks. 3 ml BME og 7 ml PBS]).
      MERK: Tilsetningen av DMS og BME kan løfte cellene fra platen hvis cellene ikke er sterkt festet. Hvis cellene løfter, kan de behandles som suspensjonsceller - i stedet for å fjerne det DMS-holdige mediet, tilsett stoppbufferen direkte og skrap ut cellene med DMS og BME i et 50 ml konisk rør. Pellet cellene ved sentrifugering i 3 minutter ved 3000 × g; sørg for å bli kvitt eventuelle gjenværende DMS, som kan pellets under cellene i store dråper. Et ekstra vasketrinn i 30% BME anbefales hvis DMS-mediet ikke kan fjernes i utgangspunktet.
    6. Skrap cellene, og overfør dem til et 15 ml konisk rør.
    7. Pellet ved sentrifugering ved 3000 × g i 3 min.
    8. Fjern supernatanten og vask 2x med 10 ml PBS.
    9. Fjern forsiktig så mye gjenværende PBS som mulig.
    10. Løs pelleten i en passende mengde RNA-isolasjonsreagens (f.eks. 3 ml for en T75-kulturkolbe, 1 ml for en 10 cm plate).
      MERK: Utilstrekkelige mengder av reagenset kan påvirke RNA-utbyttet.
  2. RNA-ekstraksjon og uttømming av ribosomal RNA (rRNA)
    1. Til 1 ml homogeniserte celler i RNA-isolasjonsreagenset, tilsett 200 μL kloroform, virvel i 15-20 s til lys rosa, og inkluder deretter i opptil 3 minutter til faseseparasjon er synlig.
      MERK: Den rosa lipidfasen skal slå seg ned nederst. Hvis dette ikke er tilfelle, var virveltiden sannsynligvis utilstrekkelig.
    2. Spinn med maksimal hastighet (~ 20 000 × g) i 15 minutter ved 4 °C.
    3. Overfør den øvre vandige fasen til et nytt rør.
    4. Rydd opp i RNA ved natriumacetat-etanolutfelling (se trinn 2.5) eller en kolonnebasert tilnærming (se trinn 2.6), og eluer i et tilstrekkelig volum NF H2O.
    5. Kontroller RNA-integriteten på en agarosegel. Se etter to bånd som tilsvarer de to ribosomale underenhetene.
    6. Tøm rRNA-ene ved hjelp av den foretrukne tilnærmingen, og eluer i et tilstrekkelig volum (typisk 20-50 μL) NF H2O.
      MERK: For nedstrøms applikasjoner foreslås ~ 500 ng av totalt RNA i et volum på 8 μL. Ikke-ribosomale RNA utgjør vanligvis bare 5% -10% av det totale RNA.
    7. Kvantifiser ved hjelp av et spektrofotometer.
  3. Generering av bibliotek
    1. Bruk genspesifikke RT-PCR eller andre tilnærminger for å generere biblioteker15. Hvis du bruker tilfeldige heksamerer for grunning, legg til et inkubasjonstrinn ved lav Tm (37-42 ° C) for å tillate heksamerglødning.
      MERK: Standard bibliotekgenereringssett kan også brukes ved å erstatte RT-enzymet med TGIRT og endre RT-temperaturen til 57 ° C.
  4. Kolonnebasert RNA-opprydding ved hjelp av RNA Clean & Concentrator-kolonnene
    MERK: Alle trinn skal utføres ved romtemperatur.
    1. Tilsett NF H2O i prøverøret for å bringe det til et volum på 50 μL.
    2. Tilsett 100 μL bindingsbuffer og 150 μL 100% etanol i prøven.
    3. Bland og overfør til en spinnkolonne.
    4. Spinn ved 10.000-16.000 × g i 30 s; Kast gjennomstrømningen.
    5. Tilsett 400 μL RNA prep-buffer.
    6. Spinn på 10.000-16.000 × g i 30 s; Kast gjennomstrømningen.
    7. Tilsett 700 μL RNA-vaskebuffer.
    8. Spinn ved 10.000-16.000 × g i 30 s; Kast gjennomstrømningen.
    9. Tilsett 400 μL RNA-vaskebuffer.
    10. Spinn ved 10.000-16.000 × g i 30 s; Kast gjennomstrømningen.
    11. (Valgfritt) Overfør kolonnen til et nytt oppsamlingsrør, og spinn ved 10.000-16.000 × g i 2 minutter.
    12. Overfør kolonnen til et rent RNAse-fritt rør og tilsett en passende mengde NF H2O.
    13. Spinn på 10.000-16.000 × g i 1 min.
  5. Syre fenol-kloroform RNA-ekstraksjon.
    1. Tilsett et like stort volum syre fenol:kloroform:isoamylalkohol.
    2. Vortex grundig, og sentrifuge på 14.000 × g i 5 min.
    3. Hvis det ikke er faseseparasjon, tilsett 20 μL 2 M NaCl, og gjenta sentrifugeringen.
    4. Overfør den vandige fasen til et nytt rør.
    5. Tilsett 500 μL isopropanol og 2 μL co-bunnfall.
    6. Bland og inkubere på RT i 3 min; Deretter ruger du ved −80 °C over natten.
    7. Pellet RNA ved sentrifugering ved maksimal hastighet (~ 20 000 × g) i 30 minutter ved 4 ° C.
    8. Vask pelletsen med 200 μL iskald 70% etanol.
    9. Spinn med maksimal hastighet (~ 20 000 × g) i 5 minutter; Kast gjennomstrømningen.
    10. Resuspender pelleten i riktig mengde NF H2O.
  6. Kolonnebasert cDNA-opprydding ved hjelp av kolonnene Oligo Clean og Concentrator
    MERK: Alle trinnene skal utføres ved romtemperatur.
    1. Tilsett NF H2O i prøverøret for å bringe det til et volum på 50 μL.
    2. Tilsett 100 μL bindingsbuffer og 400 μL 100% etanol.
    3. Bland og overfør til en spinnkolonne.
    4. Spinn ved 10.000-16.000 × g i 30 s; Kast gjennomstrømningen.
    5. Tilsett 750 μL DNA-vaskebuffer.
    6. Spinn på 10.000-16.000 × g i 30 s; Kast gjennomstrømningen.
    7. (Valgfritt) Overfør kolonnen til et nytt oppsamlingsrør og spinn på 10.000-16.000 × g i 2 minutter.
    8. Overfør kolonnen til et rent RNAse-fritt rør, og tilsett en passende mengde NF H2O.
    9. Spinn på 10.000-16.000 × g i 1 min.

3. Analyse av sekvenseringsdataene

MERK: For å lage RNA sekundære strukturmodeller fra DMS-MaP-sekvenseringsdataene, må de resulterende .fastq-filene behandles av flere forskjellige trinn. Disse trinnene kan utføres automatisk ved hjelp av

  1. Trim adaptersekvensene med TrimGalore eller Cutadapt.
  2. Tilordne lesingene til referansesekvensene (FASTA-format) ved hjelp av Bowtie2.
  3. Tell lesingene med spesialisert RNA-strukturprogramvare (f.eks. DREEM14, RNA-Framework17 eller lignende), og opprett reaktivitetsprofiler.
  4. (Valgfritt) Cluster lesingene for å finne alternative RNA-konformasjoner ved hjelp av DREEM 14, DRACO17, DANCE-MaP18 eller lignende.
  5. Forutsi minimum fri energistruktur basert på reaktivitetsprofilene ved hjelp av RNAStructure12, ViennaRNA eller lignende.
  6. Visualiser RNA11-strukturen ved hjelp av VARNA (https://varna.lri.fr/) eller lignende.
    MERK: For praktisk bruk inneholder programvare som DREEM (www.rnadreem.org) og RNA-Framework19 i stor grad trinn 1--5 i sine rørledninger, noe som effektiviserer analyseprosessen. Enhver strukturprediksjon bør imidlertid håndteres med forsiktighet (f.eks. ved å verifisere strukturens samsvar med dataene20.

Representative Results

Genspesifikk in vitro DMS-MaP
For å studere 5'UTR av SARS2 ble virusets første 300 bp bestilt som en gBlock-sekvens, sammen med tre primere. Disse inkluderte to primere for å forplante fragmentet ("FW" & "RV") via PCR, samt en for å feste T7-promotoren ("FW-T7"). Disse sekvensene kan ses i tabell 1.

Navn Sekvens (5'->3')
FW ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC
RV GCAAACTGAGTTGGACGTGT
FW-T7 TAATACGACTCACTATAGG ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC

Tabell 1: Primersekvens for DMS-MaP RT-PCR av SARS-CoV2 5'UTR. Her er FW-T7 og RV nødvendig for å generere en DNA-mal for in vitro-transkripsjon , RV brukes i revers transkripsjon og FW-RV-primerparet brukes i den påfølgende PCR-amplifiseringen av cDNA. Primerne anneal til begynnelsen av SARS-CoV2-genomet (FW) og sekvensen rett nedstrøms for interesseområdet. Forkortelser: DMS-MaP = Mutasjonsprofilering med sekvensering ved bruk av dimetylsulfat; RT-PCR = revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon; SARS-CoV2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom-coronavirus 2; UTR = uoversatt region; RV = omvendt primer; FW = fremover primer.

For å generere RNA fra gBlock-fragmentet ble sekvensen av T7-polymerasepromotoren festet ved bruk av overlappings-PCR ved bruk av PCR-premixen i henhold til skjemaet sett i figur 2A. Fra det langstrakte fragmentet ble RNA generert ved hjelp av T7 Transcription Kit. DNA-malen ble deretter fordøyd ved hjelp av DNase og RNA isolert ved hjelp av RNA Clean & Concentrator kolonner.

Kvalitetskontroll av in vitro-transkripsjonen ble gjort ved å kjøre RNA-produktet på en 1% agarosegel sammen med en ssRNA-stige. Siden det bare var ett bånd synlig, ble in vitro DMS-sondering og RT-PCR utført (se figur 2B).

For å verifisere suksessen til PCR-reaksjonen ble prøven kjørt på en 2% agarosegel ved hjelp av en dsDNA-stige. Etter indeksering skal båndet kjøre ~ 150 bp høyere på samme gel, og ta hensyn til størrelsen på indekseringsprimerne.

Figure 2
Figur 2: In vitro transkripsjon av DNA-malen. (A) For at in vitro skal transkribere en DNA-mal som ennå ikke har en iboende RNA-polymerasepromotor, må malen først festes ved overlappende PCR. Dette gjøres ved å bruke en fremoverprimer, som inkluderer sekvensen TAATACGACTCACTATAGG (i tilfelle av T7 RNA-polymerasen) oppstrøms for de første basene som overlapper med ønsket fragment. Den understrekede basen her symboliserer polymerasens transkripsjonsstartsted. Når promotoren har festet seg til dsDNA-fragmentet, kan den transkriberes av T7-polymerasen. Det er viktig at polymerasen bruker strengen i motsetning til den nevnte promotorsekvensen som mal (blå), og skaper effektivt RNA identisk med sekvensen umiddelbart nedstrøms for den angitte promotorsekvensen (rød). (B) En 1% agarosegel med en ssRNA-stige (lane 1) og in vitro transkribert RNA-produkt ved 300 nt (lane 2). (C) En 2% agarosegel med GeneRuler 1 kb pluss stige (kjørefelt 1), PCR-produktet etter RT-PCR som kjører på 300 bp (spor 2), og det indekserte fragmentet etter bibliotekforberedelse som kjører på 470 bp (bane 3). Forkortelser: RT-PCR = revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon; DMS = dimetylsulfat; nt = nukleotider; dsDNA = dobbeltstrenget DNA; ssRNA = enkeltstrenget RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Helgenom in vivo DMS-MaP ved bruk av virusinfiserte celler
Før DMS-behandlingen ble HCT-8-cellene infisert med OC43. Når cytopatisk effekt (CPE) ble observert 4 dager etter infeksjon (dpi) (som vist i figur 3A), ble disse cellene behandlet, og RNA ble ekstrahert og ribodeplert. Når du kjørte det totale RNA på en agarosegel, var to lyse bånd synlige, og utgjorde 40S- og 60S-underenhetene av ribosomet, som utgjør omtrent 95% av total RNA-masse (se figur 3B). Når RNA-ekstraksjonen var mislykket eller ble degradert (f.eks. ved flere fryse-tine-sykluser), var RNA-nedbrytningsproduktene synlige på bunnen av gelen (se figur 3C, andre felt). Videre, etter rRNA-uttømming, forsvant de to lyse båndene, og etterlot et smør i kjørefeltet (se figur 3C, tredje kjørefelt). Til slutt, etter bibliotekforberedelse, hadde prøvene varierende størrelsesfordelinger og ble vist som et smør på den endelige PAGE-gelen. Båndet ble skåret ut mellom 200 nukleotider (nt) og 500 nt, i samsvar med 150 x 150 paired-end sekvenseringskjøring planlagt for å analysere disse bibliotekene. Viktigst av alt, adapterdimerne som kjører på ~ 150 nt ble skilt ut (se figur 3D).

Figure 2
Figur 3: Sjekkpunkter for in vivo DMS-MaP med virusinfiserte celler. (A) Lysmikroskopibilde av virusinfiserte HCT-8-celler, 4 dager dpi. For å oppnå høyest mulig utbytte av viralt RNA fra det totale RNA mens du minimerer bivirkningene på grunn av celledød, bør DMS legges til når CPE starter eller til og med før det, som vist på bildet. (B) En 1% agarosegel med seks prøver på 1 μg totalt RNA. I hver bane er to lyse bånd, som står for 40S og 60S-underenhetene, synlige, da ribosomalt RNA utgjør ~ 95% av totalt RNA. Merk: In-cell DMS-behandling forårsaker noe RNA-fragmentering og smøring, men de to rRNA-båndene skal fortsatt være synlige. Mild fragmentering etter modifikasjon tolereres fordi informasjonen som inneholder metyleringsmerket genereres og rapporterer om RNA-strukturen under DMS-inkubasjonen mens cellene fortsatt er i live. (C) En 1% Agarose gel av GeneRuler 1 kb pluss stige DNA markør (lane 1) totalt RNA tidligere lagret ved -80 ° C i 6 måneder (lane 2) og ribodepleted RNA (lane 3). Ved lagring av RNA i lang tid med flere fryse-tine-sykluser, begynner RNA å nedbrytes og bør muligens ikke brukes til sonderingseksperimenter. Videre, etter å ha ribodeplet det totale RNA, begynner de to lyse båndene, som står for 40S- og 60S-underenhetene av ribosomet, og et smør av de resterende RNA-ene begynner å vise seg. (D) En PAGE gel av GeneRuler 1 kb pluss stige DNA markør (lane 1) og et bibliotek prøve av hele genom forberedt RNA. Gelen skal fjernes basert på sekvenseringsbehovene. For en sekvenseringskjøring i paret som spenner over 150 sykluser fra begge sider, bør gelen fjernes mellom 300 bp og 500 bp. Adapterdimere (kjører på 170 bp) skal skilles ut. Forkortelser: DMS-MaP = Mutasjonsprofilering med sekvensering ved bruk av dimetylsulfat; dpi = dager etter infeksjon; CPE = cytopatisk effekt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Etter sekvensering ble fastq-filene analysert ved å sende en jobb til DREEM-webserveren (http://rnadreem.org/), sammen med en fasta-referansefil. Utdataene som genereres av serveren inkluderer kvalitetskontrollfiler generert av fastqc (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) og TrimGalore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), samt andre utdatafiler som inneholder populasjonens gjennomsnittlige mutasjonsfrekvenser. Bortsett fra diagrammet som viser mutasjonsfrekvensene med et interaktivt .html (se figur 4A) -format og en .csv-fil med rå reaktiveringer per base og en struct_constraint.txt-fil, lesbar av flere RNA-strukturprediksjonsprogramvare, inkluderer dette også en bitvector.txt fil som rapporterer om bi-read-mutasjonene. Fra disse ble befolkningens gjennomsnittlige strukturer beregnet ved å sende .fasta- og struct_constraint.txt-filene til RNAfold-webserveren (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi). Dette bruker ViennaRNA-programvaren til å generere strukturforutsigelser basert på minimum fri energi, som kan vises online eller lastes ned i ct- eller Wien-format. For å generere RNA-strukturmodeller ble disse nedlastbare filene sendt til VARNA (https://varna.lri.fr/, se figur 4B). Til slutt kan bitvector.txt filer brukes av den stabile versjonen av DREEM (https://codeocean.com/capsule/6175523/tree/v1) for å søke etter alternative RNA-konformasjoner. For å oppnå gode strukturmodeller ved bruk av DREEM, bør det oppnås en dekning på 10 000 avlesninger per base; For klynger kan det være nødvendig med opptil 100 000 avlesninger per base. En oversikt over hele arbeidsflyten finner du i figur 4C.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på data hentet fra kjemiske sonderingseksperimenter av SARS-CoV2 5'UTR. (A) Reaktivitetsprofil for de første 300 basene i SARS-CoV2-genomet farget etter base (A: rød, C: blå, U: grønn, G: gul). De rå reaktivitetene beregnes som den absolutte mutasjonsfrekvensen dividert med dekningen. Baser med åpen konformasjon har høye reaktivitetsverdier; Baser som deltar i baseparing har lave reaktivitetsverdier. U og G er ikke modifisert av DMS og har lave reaktivitetsverdier som stammer fra polymerase-utroskap. Spådommene ble gjort med DREEM webserver. (B) Strukturmodell av SARS-CoV2 5'UTR predikert fra reaktivitetsverdier laget med VARNA. Baser med høye reaktivitetsverdier er farget i rødt; Baser med lave reaktivitetsverdier er farget i hvitt. (C) Arbeidsflyt for DMS-MaP-analysen som starter med .fastq-filene hentet fra sekvensering. Disse kan kvalitetssikres ved hjelp av fastqc; adaptersekvensene trimmes ved hjelp av TrimGalore og kartlegges deretter tilbake til en referansesekvens ved hjelp av Bowtie2. Fra de oppnådde .bam-filene teller DREEM mutasjonene i hver lesing, og skaper et mutasjonskart eller .bitvector.txt-fil. Disse rapporterer mutasjonene til hver lest på en posisjonsavhengig måte, basert på hvilken befolkningens gjennomsnittlige reaktivitetsprofiler kan opprettes. Alternativt kan bitvektorer grupperes ved hjelp av DREEM for å søke etter alternative RNA-konformasjoner. Til slutt visualiseres de oppnådde strukturmodellene ved hjelp av programvare (f.eks. Forkortelser: DMS-MaP = Mutasjonsprofilering med sekvensering ved bruk av dimetylsulfat; SARS-CoV2 = alvorlig akutt luftveissyndrom-koronavirus 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Protokollen her beskriver hvordan man kan undersøke RNA in vitro og i celler ved hjelp av DMS-mutasjonsprofileringseksperimenter. Videre gir den instruksjoner om hvordan du forbereder biblioteker for Illumina-sekvensering for å generere genspesifikke data og analysere de oppnådde .fastq-filene. I tillegg kan genom-wide bibliotek tilnærminger brukes. Genspesifikk RT-PCR produserer imidlertid den høyeste kvaliteten og mest robuste data. Derfor, hvis man sammenligner mellom prøver, er det viktig å sikre at de er forberedt med identiske sekvenseringsstrategier, da bibliotekgenereringen forårsaker en viss skjevhet. Reproduserbarheten skal alltid måles ved hjelp av replikasjoner.

Flere forholdsregler
RNA er et ustabilt molekyl som er følsomt for nedbrytning både gjennom forhøyede temperaturer og ved RNaser. Derfor anbefales spesielle tiltak - bruk av personlig verneutstyr (PPE), RNAse-fritt materiale og RNAse-hemmere. Det viktigste er at RNA holdes på is når det er mulig. Dette gjelder spesielt metylert RNA, som er enda mer følsomt for høye temperaturer.

Det er viktig å bekrefte at RNA-strukturen av interesse ikke er følsom for DMS-konsentrasjons- og bufferforholdene. Buffere som 100 mM Tris, 100 mM MOPS og 100 mM HEPES ved pH 7-7,5 gir et høyt signal, men er kanskje ikke tilstrekkelig til å opprettholde pH under reaksjonen21. Siden DMS hydrolyserer i vann, noe som reduserer pH, er en sterk buffer avgjørende for å opprettholde en nøytral pH under modifikasjonsreaksjonen. Tilsetningen av bicin har vist seg å bidra til å opprettholde pH som litt grunnleggende21 , men resulterer i lav DMS-modifikasjon på Gs og Us, som kan være informativ, men bør analyseres separat på grunn av produksjon av et mye lavere signal enn As og Cs og er ikke diskutert videre i denne protokollen.

I genspesifikk RT-PCR blir det modifiserte RNA reversert transkribert til DNA og forsterket i fragmenter ved PCR. Mens størrelsen på RNA teoretisk kan være ubegrenset, bør disse PCR-fragmentene ikke overstige en lengde på 400-500 basepar (bp) for å forhindre skjevhet under revers transkripsjonsreaksjon. Ideelt sett bør fragmentene være innenfor rammen av sekvenseringskjøringen (dvs. hvis sekvensering utføres ved hjelp av et 150 x 150 syklus sammenkoblet sekvenseringsprogram, bør et enkelt fragment ikke overstige 300 bp). Ved bruk av sekvenseringsprogrammer med færre sykluser kan PCR-produktene fragmenteres ved hjelp av en dsDNase. Videre, ettersom sekvenser i primersekvensene ikke inneholder noen strukturell informasjon, må fragmentene overlappe når det probede RNA består av >1-fragment. RT-reaksjoner kan inneholde flere RT-primere for forskjellige fragmenter (opptil 10 forskjellige RT-primere). Avhengig av sekvensene kan sammenslåing av RT-primerne gjøre revers transkripsjon mindre effektiv, men fungerer vanligvis bra. Hver PCR-reaksjon bør utføres separat.

Ved sondering av RNA med DMS spiller de eksperimentelle forholdene en ekstra rolle, da mange RNA er termodynamisk ustabile og endrer konformasjon basert på miljøfaktorer som temperatur. For å unngå uregelmessigheter, bør de eksperimentelle forholdene holdes så konstante som mulig, også med hensyn til reaksjonstider. Bufferbetingelsene ser ut til å kunne byttes til en viss grad 17,20,22,23 når de grunnleggende forholdene opprettholdes - bufferkapasiteten og tilstedeværelsen av monovalente (Na) og divalente ioner (Mg) - for å sikre riktig folding av RNA 24.

Når det gjelder bibliotekets forberedelse av modifiserte RNA, må flere aspekter tas i betraktning. For det første, som nevnt tidligere, er modifiserte RNA mindre stabile enn deres umodifiserte kolleger, noe som betyr at de kan kreve optimalisering av fragmenteringstidene for optimal fragmentstørrelsesfordeling. Videre bruker visse RNA-bibliotekforberedelsessett, så vel som mange andre RNAseq-tilnærminger, tilfeldige primere i omvendt transkripsjonssett. Dette kan føre til lavere dekning av referansen, spesielt i 3 'av et gen, og til slutt til utilstrekkelig dekningsdybde. Hvis dekningen av en bestemt region er for lav, kan det være nødvendig å fjerne disse basene fra strukturprediksjonen. Bortsett fra RT-PCR og hele genom RNAseq-sett, kan andre biblioteksforberedelsesmetoder brukes. Protokoller som inkluderer ligering av 3 'og / eller 5' adaptere til RNA er fordelaktige ved bruk av små fragmenter av RNA eller når tap av sonderingsinformasjon i primerregionene må unngås.

Til slutt må analysen av de kjemiske sonderingsforsøkene alltid tolkes nøye. For øyeblikket er det ingen programvare som forutsier RNA-strukturen til noe RNA fra sekvensen alene med høy nøyaktighet. Selv om begrensninger i kjemisk sondering forbedrer nøyaktigheten betydelig, er det fortsatt utfordrende å generere gode modeller for lange RNA (>500 nt). Disse modellene bør testes videre ved andre tilnærminger og / eller mutagenese. RNA-prediksjonsprogramvare optimaliserer for maksimalt antall basepar, og straffer dermed åpne konformasjoner betydelig, noe som kanskje ikke nøyaktig representerer RNA-folding5. Dermed bør den oppnådde strukturmodellen testes ved å kvantifisere prediksjonsavtalen med de underliggende kjemiske sonderingsdataene (f.eks. av AUROC) og mellom replikasjoner (f.eks. ved mFMI), som eksemplifisert av Lan et al.20.

Ideelt sett bør flere eksperimenter i forskjellige systemer for å utfordre den oppnådde strukturmodellen brukes til å styrke ens hypotese. Disse kan omfatte bruk av in vitro og in-cell tilnærminger, kompenserende mutasjoner, og forskjellige cellelinjer og arter. Videre er rå reaktiviteter ofte like eller enda mer informative enn strukturforutsigelser, da de registrerer øyeblikksbildet av "bakken sannhet" av RNA-foldingsensemblet. Som sådan er rå reaktiviteter svært egnet og informativ for å sammenligne strukturendringer mellom ulike forhold. Det er viktig at de laveste frie energistrukturene beregnet ved hjelp av kjemiske sonderingsbegrensninger med beregningsprediksjon bare skal brukes som en starthypotese mot en komplett strukturmodell.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA Ladder 10787018 Thermo
2-mercaptoethanol M6250-250ML Sigma
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 AM9720 Thermo
Advantage PCR 639206 Takara
CloneAmp HiFi PCR Premix 639298 Takara
DMS D186309
 		 Sigma
dNTPs 10 mM each U151B Promega
E-Gel EX Agarose Gels, 2% G402022 Thermo precast agarose gels
Ethanol (200 proof) E7023-4X4L Sigma
Falcon tubes, 15 mL, 50 mL
GlycoBlue co-precipitant
HCT-8 cells  ATCC #CCL-244
Invitrogen MgCl2 (1 M) AM9530G fisherscientific
Isopropanol 278475 Sigma
Megascript T7 transcription AM1334 Thermo
NanoDrop spectrophotometer
Novex TBE Gels, 8%, 10 well EC6215BOX Thermo
OC43  ATCC #VR-1558
RiboRuler Low Range RNA Ladder SM1831 Thermo
RNAse H M0297L NEB
Sodium Cacodylate, 0.4 M, pH 7.2 102090-964 VWR
Sodium hydroxide solution S8263-150ML Sigma
SuperScript II Reverse Transcriptase for FSB and DTT 18064014 Thermo
TGIRT-III Enzyme TGIRT50 Ingex
The Oligo Clean & Concentrator D4060 Genesee
The RNA Clean & Concentrator kits are RNA clean up kits R1016 Genesee
TRIzol Reagents 15596018 Thermo RNA isolation reagent
Water, (For RNA Work) (DEPC-Treated, DNASE, RNASE free/Mol. Biol.) BP561-1 fisherscientific
xGen Broad-range RNA Library Prep 16rxn 10009865 IDT
Zymo RNA clean and concentrator columns

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S. H., et al. Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA. Science. 185 (4149), 435-440 (1974).
  2. Robertus, J. D., et al. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Å resolution. Nature. 250 (467), 546-551 (1974).
  3. Zaug, A. J., Cech, T. R. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor in nuclei of Tetrahymena. Cell. 19 (2), 331-338 (1980).
  4. Zhao, Y., et al. NONCODE 2016: An informative and valuable data source of long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 44, D203-D208 (2016).
  5. Vandivier, L. E., Anderson, S. J., Foley, S. W., Gregory, B. D. The conservation and function of RNA secondary structure in plants. Annual Review of Plant Biology. 67, 463 (2016).
  6. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  7. Das, R. RNA structure: A renaissance begins. Nature Methods. 18 (5), 439-439 (2021).
  8. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10 (11), 1643-1669 (2015).
  9. Mathews, D. H., et al. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7287-7292 (2004).
  10. Zuker, M., Stiegler, P. Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information. Nucleic Acids Research. 9 (1), 133-148 (1981).
  11. Lorenz, R., et al. ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6, (2011).
  12. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, (2010).
  13. Wells, S. E., Hughes, J. M. X., Igel, A. H., Ares, M. Use of dimethyl sulfate to probe RNA structure in vivo. Methods in Enzymology. , 479-493 (2000).
  14. Tomezsko, P. J., et al. Determination of RNA structural diversity and its role in HIV-1 RNA splicing. Nature. 582 (7812), (2020).
  15. Zubradt, M., et al. DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo. Nature Methods. 14 (1), (2017).
  16. Woodson, S. A. Compact intermediates in RNA folding. Annual Reviews in Biophysics. 39, (2010).
  17. Morandi, E., et al. Genome-scale deconvolution of RNA structure ensembles. Nature Methods. 18 (3), 249-252 (2021).
  18. Olson, S. W., et al. Discovery of a large-scale, cell-state-responsive allosteric switch in the 7SK RNA using DANCE-MaP. Molecular Cell. 82 (9), 1708-1723 (2022).
  19. Incarnato, D., Morandi, E., Simon, L. M., Oliviero, S. RNA Framework: An all-in-one toolkit for the analysis of RNA structures and post-transcriptional modifications. Nucleic Acids Research. 46 (16), (2018).
  20. Lan, T. C. T., et al. Secondary structural ensembles of the SARS-CoV-2 RNA genome in infected cells. Nature Communications. 13 (1), 1128 (2022).
  21. Homan, P. J., et al. Single-molecule correlated chemical probing of RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (38), 13858-13863 (2014).
  22. Yang, S. L., et al. Comprehensive mapping of SARS-CoV-2 interactions in vivo reveals functional virus-host interactions. Nature Communications. 12 (1), 5113 (2021).
  23. Manfredonia, I., et al. Genome-wide mapping of SARS-CoV-2 RNA structures identifies therapeutically-relevant elements. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12436-12452 (2020).
  24. Fischer, N. M., Polěto, M. D., Steuer, J., vander Spoel, D. Influence of Na+ and Mg2+ ions on RNA structures studied with molecular dynamics simulations. Nucleic Acids Research. 46 (10), 4872-4882 (2018).

Tags

Biokjemi utgave 190
Sondering av RNA-struktur med dimetylsulfatmutasjonsprofilering med sekvensering <em>in vitro</em> og i celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dülk, S. L., Rouskin, S.… More

Dülk, S. L., Rouskin, S. Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells. J. Vis. Exp. (190), e64820, doi:10.3791/64820 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter