Summary

פיגומי הידרוג'ל גרגיריים מג'לטין מתקרילויל: ייצור מיקרוג'ל בתפוקה גבוהה, ליופיליזציה, הרכבה כימית והדפסה ביולוגית תלת-ממדית

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקולים לייצור מיקרו-ג’ל ג’לטין מתקרילויל בתפוקה גבוהה באמצעות התקנים מיקרופלואידים, המרת מיקרו-ג’לים לאבקה מתרחפת (מיקרו-אירוג’לים), הרכבה כימית של מיקרו-ג’לים ליצירת פיגומי הידרוג’ל גרגיריים, ופיתוח ביו-דיו הידרוג’ל גרגירי עם מיקרו-נקבוביות משומרת להדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

Abstract

הופעתם של פיגומי הידרוג’ל גרגיריים (GHS), המיוצרים באמצעות הרכבת מיקרו-חלקיקי הידרוג’ל (HMPs), אפשרה היווצרות פיגומים מיקרו-נקבוביים באתרם. שלא כמו הידרוג’לים קונבנציונליים בתפזורת, נקבוביות מיקרוסקוליות מחוברות זו לזו ב-GHS מאפשרות חדירת תאים שאינה תלויה בהתפרקות, כמו גם העברת חמצן, חומרים מזינים ותוצרי לוואי של תאים. ג’לטין מהונדס Methacryloyl (GelMA), ביופולימר מבוסס חלבון הניתן להצלבה כימית המכיל דבק תאים ומויטי מתכלים, נמצא בשימוש נרחב כחומר ביולוגי מגיב לתאים/מאלף. המרת GelMA בתפזורת ל- GHS עשויה לפתוח שפע של הזדמנויות להנדסת רקמות והתחדשות. במאמר זה, אנו מדגימים את ההליכים של ייצור מיקרו-ג’ל GelMA בתפוקה גבוהה, המרה למיקרו-ג’לים יבשים הניתנים להשעיה חוזרת (מיקרו-אירוג’לים), היווצרות GHS באמצעות הרכבה כימית של מיקרו-ג’לים, וייצור ביו-דיו גרעיני להדפסה ביולוגית של אקסטרוזיה. אנו מראים כיצד טיפול פיסיקוכימי רציף באמצעות קירור ופוטוקרוסלינקינג מאפשר היווצרות GHS חזק מבחינה מכנית. כאשר האור אינו נגיש (למשל, במהלך הזרקת רקמות עמוקה), ניתן להרכיב ביו-אורתוגונלים של GelMA HMPs מוצלבים בנפרד באמצעות קרוסלינקינג אנזימטי באמצעות טרנסגלוטמינאזות. לבסוף, הדפסה ביולוגית תלת-ממדית (תלת-ממדית) של GHS מיקרו-נקבובי בצפיפות אריזה נמוכה של HMP מודגמת באמצעות הרכבה עצמית בין-פנים של ננו-חלקיקים הטעונים הטרוגנית.

Introduction

הרכבת אבני בניין של HMP ליצירת פיגומים הנדסיים לרקמות זכתה לתשומת לב עצומה בשנים האחרונות1. GHS, המיוצרים באמצעות הרכבת HMP, הם בעלי תכונות ייחודיות בהשוואה למקביליהם בתפזורת, כולל מיקרופורוזיות בקנה מידה תאי שמקורן בחללים החלקיים בין אבני הבניין הבדידות. תכונות נוספות, כגון יכולת הזרקה, מודולריות ונוקשות מנותקת מנקבוביות, הופכות את GHS לפלטפורמה מבטיחה לשיפור תיקון רקמות והתחדשות2. ביו-חומרים שונים שימשו לייצור GHS, כולל פולימרים סינתטיים מבוססי PEG3,4 ורב-סוכרים, כגון אלגינט5 וחומצה היאלורונית 6,7. מבין הפולימרים ממקור טבעי, הביופולימר מבוסס החלבון הנפוץ ביותר לייצור GHS הוא GelMA 8,9,10,11, חומר ביולוגי12,13 הניתן להצלבה, תואם ביולוגית, דבק ביולוגי ומתכלה.

ניתן לייצר HMPs באמצעות תחליב אצווה8, מיקוד זרימה 14,15 או תחליב שלב9,11 התקנים מיקרופלואידים, ערבוב 16, או coacervationמורכב 17,18. בדרך כלל, יש פשרה בין תפוקת הייצור לבין חד-פיזור HMP. לדוגמה, טכניקת המיזוג מניבה HMPs בעלי צורה לא סדירה ומפוזרים מאוד. תחליב אצווה או קו-סרבציה מורכבת מאפשר ייצור של כמויות גדולות של HMPs כדוריים רב-מפוזרים. התקנים מיקרופלואידים ממוקדי זרימה שימשו לייצור טיפות חד-פזורות מאוד עם מקדם שונות של <5%, אולם התפוקה נמוכה משמעותית. בהתקנים מיקרופלואידים של תחליב צעדים, השלבים המקביליים מאוד מאפשרים ייצור בתפוקה גבוהה של HMPsחד-מפוזרים 19.

אבני הבניין של HMP מג’לטין מעובד Methacryloyl (GelMA) מגיבות לחום וניתנות להצלבה כימית, מה שמאפשר ייצור GHS קל20. עם קירור מתחת לטמפרטורת התמיסה הקריטית העליונה (UCST)21 (למשל, ב-4°C), טיפות המכילות תמיסת GelMA מומרות לקופות חולים מוצלבות פיזית. אבני בניין אלה של HMP נארזות לאחר מכן באמצעות כוחות חיצוניים (למשל, באמצעות צנטריפוגה) כדי להניב מתלי מיקרוג’ל תקועים. קשרים בין חלקיקים נוצרים בין HMPs סמוכים באמצעות קרוסלינקינג כימי (פוטו) ליצירת GHS14 חזק מכנית. אחת התכונות החשובות ביותר של GHS היא מיקרופורוזיות, המאפשרת חדירה קלה של תאים במבחנה11 וצמיחה מוגברת של רקמות in vivo22. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית (תלת-ממדית) של HMPs מתבצעת באופן קונבנציונלי באמצעות מתלי מיקרו-ג’ל צפופים, תוך התפשרות על מיקרו-נקבוביות23.

לאחרונה פיתחנו סוג חדש של ביו-דיו גרעיני המבוסס על ננו-הנדסה בין-פנים של מיקרו-ג’לים GelMA באמצעות ספיחה של ננו-חלקיקים טעונים הטרוגנית, ולאחר מכן הרכבה עצמית הפיכה של ננו-חלקיקים. אסטרטגיה זו הופכת מיקרו-ג’לים ארוזים באופן רופף למניבי גזירה ושחול להדפסה ביולוגית תלת-ממדית, המשמרת את הנקבוביות בקנה מידה מיקרוסקולרי של GHS11 המיוצר בתוספים. מאמר זה מציג את השיטות לייצור טיפות GelMA בתפוקה גבוהה, המרת טיפות אלה ל- HMPs מוצלבים פיזית, ייצור HMPs של GelMA באמצעות אבקה ניתנת להשעיה, היווצרות GelMA GHS, הכנת ביודיו גרעיני ננו-מהונדס של GelMA (NGB) והדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. 1. סינתזת GelMA הערה: סינתזת GelMA צריכה להתבצע במכסה אדים כימי, ויש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) כל הזמן. הוסף 200 מ”ל של מלח חוצץ פוספט של Dul…

Representative Results

GelMA סונתז באמצעות התגובה של ג’לטין עם MA, כפי שמוצג באיור 1A. על ידי התאמת תנאי התגובה, כגון ריכוז MA, התקבלו דרגות שונות של החלפת MA. כדי לכמת את מידת ההחלפה של MA, GelMA הוערכה באמצעות ספקטרוסקופיית NMR של 1H (איור 1B). קבוצות פונקציונליות ויניל עם שיאים מייצג?…

Discussion

ג’לטין ונגזרותיו הם הביו-חומרים מבוססי החלבון הנפוצים ביותר לייצור HMP. ניתן להתגבר על האתגר של תפוקה לעומת גודל חלקיקים, ניתן להתגבר על פשרה באמצעות התקנים מיקרופלואידים של תחליב צעדים. מכשירים אלה מסוגלים ליצור יותר מ -40 מיליון טיפות בשעה, עם מקדם שונות פחות מ -5% 27. במאמר זה דנו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לט’ פונד, מומחה לתמיכה במחקר במחלקה להנדסה כימית באוניברסיטת פנסילבניה סטייט (פן סטייט), לצוות מעבדת הננו-פבריקציה בפן סטייט, ולד”ר ג’יי דה רוטה מ-Partillion Bioscience על העזרה והדיון בנוגע לתהליכי ננו-פבריקציה. א. שייח’י מודה על תמיכתם של המכון לחקר חומרים (MRI) והמכללה לחומר הנדסי במענקי זרעים ברמה האנושית, מרכז ההתכנסות למערכות חומרים רב-תכליתיות חיות (LiMC2) ואשכול המצוינות בחיים, מערכות חומרים אדפטיביות ואוטונומיות אנרגיה (livMatS) חומרים חיים רב-תכליתיים תוכנית מענקי זרעים למחקר שיתופי, וקרן הסטארט-אפ מפן סטייט. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך חלקית על ידי המכון הלאומי לדימות ביו-רפואי וביו-הנדסה (NIBIB) של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת פרס מספר R56EB032672.

Materials

1H,1H-perfluoro-1-octanol Alfa Aesar, MA, USA B20156-18 98% purity
Biopsy punch Integra Miltex, NY, USA 33-31A-P/25 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needle SANANTS 30-002-25 25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz 400 MHz Bruker NEO, MA, USA NMR device
Centrifuge Eppendorf, Germany 5415 C
Centrifuge tube Celltreat, MA ,USA 229423
Coffee filters BUNN, IL, USA 20104.0006 BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator Thermo Scientific 5311-0250 Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxide Sigma, MA, USA 151882
Dialysis membrane (12-14 kDa) Spectrum Laboratories, NJ, USA 08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) Sigma, MA, USA 56064C-10L dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flask Corning, NY, USA 4980 Corning PYREX 
Ethanol VWR, PA, USA 89125-188 Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials) Corning, NY, USA 430659
Freeze dryer Labconco, MO, USA 71042000 Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powder Sigma, MA, USA G1890-5100G Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slides VWR, PA, USA 82027-788
Hotplate FOUR E'S SCIENTIFIC MI0102003 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F 
Kimwipes Fischer scientific, MA, USA 06-666
KMPR 1000 negative photoresist series Kayaku Advanced Materials, MA, USA 121619 KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLG BYK USA Inc., CT, USA 2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma, MA, USA 900889-1G >95%
Luer-Lok connector BD, NJ, USA BD 302995 
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner SÜSS MicroTeck, German Nanofabrication device
Methacylate anhydride Sigma, MA, USA 276685-100ML contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q water Millipore Corporation, MA, USA ZRQSVR5WW electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid 3M, MN, USA 3M ID 7100003723
Oven VWR, PA, USA VWR-1410 1410 Vacuum Oven
Parafilm Fischer scientific, MA, USA HS234526C
Pasteur pipette VWR, PA, USA 14673-010
Petri dish VWR, PA, USA 25384-092 polystyrene
Pico-Surf Sphere Fluidics, UK C022 (5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette VWR, PA, USA 89079-970
Pipette tips VWR, PA, USA 87006-060
Plasma cleaner chamber Harrick Plasma, NY, USA PDC-001-HP 
Polydimethylsiloxane Dow Corning, MI, USA  2065623 SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipette Microman E M100E, Gilson, OH, USA M100E
Silicon wafers UniversityWafer, MA, USA 452/1196 4-inch mechanical grade
Spatula VWR, PA, USA 231-0104 Disposable
SU-8  Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pump Harvard Apparatus, MA, USA 70-2001 PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Millipore Sigma, MA, USA 448931-10G 97%
Tygon tubings Saint-globain, PA, USA AAD04103 
UV light  QUANS Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unit VWR, PA, USA 10040-460 0.20 µm
Vortex Fischer scientific, USA 14-955-151 Mini Vortex Mixer

References

  1. Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  3. Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  4. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  5. Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
  6. Muir, V. G., et al. Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 18 (36), 2201115 (2022).
  7. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  8. Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication. Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).
  9. Zoratto, N., et al. In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering. Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).
  10. Yuan, Z., et al. In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care. Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).
  11. Ataie, Z., et al. Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting. Small. 18 (37), 2202390 (2022).
  12. Annabi, N., et al. 25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
  13. Rajabi, N., et al. Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair. Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).
  14. Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , (2021).
  15. Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
  16. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
  17. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
  18. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  19. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
  20. Sheikhi, A., et al. Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization. MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).
  21. Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
  22. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
  23. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3d printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
  24. Claaßen, C., et al. Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls. Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).
  25. Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , (2022).
  26. Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
  27. Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules. ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).
  28. Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. Mechanical reinforcement of granular hydrogels. Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).

Play Video

Cite This Article
Ataie, Z., Jaberi, A., Kheirabadi, S., Risbud, A., Sheikhi, A. Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (190), e64829, doi:10.3791/64829 (2022).

View Video