Summary

젤라틴 메타크릴로일 과립형 하이드로겔 스캐폴드: 고처리량 마이크로겔 제조, 동결건조, 화학 조립 및 3D 바이오프린팅

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

이 기사에서는 미세유체 장치를 사용한 고처리량 젤라틴 메타크릴로일 마이크로겔 제조, 마이크로젤을 부유 가능한 분말(마이크로 에어로젤)로 변환, 마이크로겔의 화학적 조립을 위한 입상 하이드로겔 스캐폴드, 3D 바이오프린팅을 위한 미세 다공성이 보존된 입상 하이드로겔 바이오잉크 개발에 대해 설명합니다.

Abstract

하이드로겔 미세입자(HMP) 조립을 통해 제작된 입상 하이드로겔 스캐폴드(GHS)의 출현으로 현장에서 미세 다공성 스캐폴드 형성 이 가능해졌습니다. 기존의 벌크 하이드로겔과 달리 GHS의 상호 연결된 마이크로 스케일 기공은 분해와 무관한 세포 침투와 산소, 영양소 및 세포 부산물 전달을 촉진합니다. 메타크릴로일 변성 젤라틴(GelMA)은 세포 접착성 및 생분해성 부분을 포함하는 (광)화학적으로 가교 가능한 단백질 기반 생체 고분자로 세포 반응성/지시성 생체 재료로 널리 사용되었습니다. 벌크 GelMA를 GHS로 전환하면 조직 공학 및 재생을 위한 많은 기회가 열릴 수 있습니다. 이 기사에서는 고처리량 GelMA 마이크로겔 제조, 재현탁 가능한 건조 마이크로겔(마이크로 에어로젤)로의 전환, 마이크로젤의 화학적 조립을 통한 GHS 형성 및 압출 바이오프린팅을 위한 과립형 바이오잉크 제조 절차를 보여줍니다. 냉각 및 광가교를 통한 순차적인 물리화학적 처리가 기계적으로 견고한 GHS를 형성하는 방법을 보여줍니다. 빛에 접근할 수 없는 경우(: 심부 조직 주입 중), 개별적으로 가교된 GelMA HMP는 트랜스글루타미나제를 사용한 효소 가교를 통해 생체직교적으로 조립될 수 있습니다. 마지막으로, 낮은 HMP 패킹 밀도에서 미세 다공성 GHS의 3차원(3D) 바이오프린팅은 이질적으로 하전된 나노입자의 계면 자가 조립을 통해 입증됩니다.

Introduction

조직 공학 스캐폴드를 형성하기 위해 HMP 빌딩 블록을 조립하는 것은지난 몇 년 동안 엄청난 주목을 받았습니다1. HMP 어셈블리를 통해 제작된 GHS는 개별 빌딩 블록 사이의 빈 공간에서 발생하는 셀 규모의 미세 다공성을 포함하여 벌크 대응 제품에 비해 고유한 특성을 가지고 있습니다. 주입성, 모듈성, 다공성에서 분리된 강성과 같은 추가 특성으로 인해 GHS는 조직 복구 및 재생을 향상시키는 유망한 플랫폼이 되었습니다2. 합성 PEG 기반 폴리머3,4 및 알 지네이트5 및 히알루론산 6,7과 같은 다당류를 포함하여 다양한 생체 재료가 GHS 제조에 사용되었습니다. 천연 유래 고분자 중에서 GHS 제조를 위한 가장 일반적인 단백질 기반 생체 고분자는 가교성, 생체적합성, 생체접착성 및 생분해성 생체재료인 GelMA 8,9,10,11 입니다12,13.

HMP는 배치 유화(batch emulsification)(8), 유동-포커싱(flow-focusing)(14, 15) 또는 스텝-유화(step-emulsification)(9,11) 미세유체 장치, 블렌딩(blending)(16), 또는 복합 코아세르베이션(complex coacervation)(17, 18)을 통해 제조될 수 있다. 일반적으로 제조 처리량과 HMP 단분산성 사이에는 절충점이 있습니다. 예를 들어, 블렌딩 기술은 불규칙한 모양의 고도로 분산된 HMP를 생성합니다. 배치 유화 또는 복합 코아세르베이션을 통해 대량의 다분산 구형 HMP를 생산할 수 있습니다. 유동 집속 미세유체 장치는 <5%의 변동 계수를 갖는 고도로 단분산된 액적을 제조하는 데 사용되었지만 처리량은 상당히 낮습니다. 스텝-유화 미세유체 장치에서, 고도로 병렬화된 스텝들은 단분산HMPs(19)의 고-처리량 제조를 가능하게 한다.

메타크릴로일 변성 젤라틴(GelMA) HMP 빌딩 블록은 열에 반응하고 (광)화학적으로 가교 결합이 가능하여 GHS 제조가 용이합니다20. 상부 임계 용액 온도(UCST)21 이하로 냉각되면(예: 4°C에서) GelMA 용액을 포함하는 액적이 물리적으로 가교된 HMP로 전환됩니다. 그런 다음 이러한 HMP 빌딩 블록은 걸린 마이크로겔 현탁액을 생성하기 위해 외부 힘(예: 원심분리를 통해)을 사용하여 패킹됩니다. (광)화학적 가교를 통해 인접한 HMP 사이에 입자 간 결합이 형성되어 기계적으로 견고한 GHS14를 형성합니다. GHS의 가장 중요한 특성 중 하나는 미세 다공성으로, 시험관 내 세포 침투를 용이하게 하고(11) 생체 내에서 조직 내 성장을 강화합니다(22). HMP의 3차원(3D) 바이오프린팅은 통상적으로 밀집된 마이크로겔 현탁액을 사용하여 수행되며, 미세 다공성을 손상시킨다23.

우리는 최근 이질적으로 하전된 나노 입자의 흡착을 통해 GelMA 마이크로 젤의 계면 나노 엔지니어링을 기반으로 한 새로운 종류의 과립 바이오 잉크를 개발 한 후 나노 입자 가역적 자기 조립을 개발했습니다. 이 전략은 느슨하게 포장된 마이크로젤을 전단 항복 및 압출 3D 바이오프린팅이 가능하게 하여 적층 제조된 GHS11의 미세 다공성을 보존합니다. 이 기사에서는 고처리량 GelMA 액적 제조 방법, 이러한 액적을 물리적으로 가교된 HMP로 변환, 재현탁 가능한 분말을 사용하여 GelMA HMP 제조, GelMA GHS 형성, GelMA 나노 공학 과립 바이오잉크(NGB) 준비 및 3D 바이오프린팅을 제공합니다.

Protocol

알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 1. GelMA 합성 알림: GelMA 합성은 화학 흄 후드에서 수행해야 하며 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다. 200mL의 Dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS, 1x)을 삼각 플라스크에 넣고 용액을 50°C에 도달할 때까지 가열…

Representative Results

GelMA는 그림 1A에 제시된 바와 같이 젤라틴과 MA의 반응을 통해 합성되었습니다. MA 농도와 같은 반응 조건을 조정함으로써, 상이한 MA 치환도가 얻어졌다. MA 치환 정도를 정량화하기 위해, GelMA를 1H NMR 분광법을 통해 평가하였다(도 1B). ~5-6 ppm의 화학적 이동에서 대표적인 피크를 갖는 비닐 작용기는 젤라틴으로부터 성공적인 GelMA 합성을 ?…

Discussion

젤라틴과 그 유도체는 HMP 제조에 가장 일반적으로 사용되는 단백질 기반 생체 재료입니다. 처리량 대 입자 크기 단분산 절충의 문제는 스텝 유화 미세유체 장치를 사용하여 극복할 수 있습니다. 이 장치는 시간당 4천만 개 이상의 물방울을 형성할 수 있으며 변동 계수는 5%27 미만입니다. 이 기사에서는 GelMA 용액을 포함하는 액적의 미세 가공에 대해 논의한 후 GelMA HMP, 분말, GHS 및…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 펜실베니아 주립 대학 (Penn State)의 화학 공학과의 연구 지원 전문가 인 T. Pond, Penn State의 Nanofabrication Lab 직원 및 Partillion Bioscience의 J. de Rutte 박사에게 나노 제조 공정에 대한 도움과 토론에 감사드립니다. A. Sheikhi는 Materials Research Institute (MRI) 및 College of Engineering Materials Matter at the Human Level 종자 보조금, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) 및 Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-Autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program 및 Penn State의 창업 기금. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 R56EB032672로 NIH(National Institutes of Health)의 NIBIB(National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering)에서 부분적으로 지원했습니다.

Materials

1H,1H-perfluoro-1-octanol Alfa Aesar, MA, USA B20156-18 98% purity
Biopsy punch Integra Miltex, NY, USA 33-31A-P/25 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needle SANANTS 30-002-25 25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz 400 MHz Bruker NEO, MA, USA NMR device
Centrifuge Eppendorf, Germany 5415 C
Centrifuge tube Celltreat, MA ,USA 229423
Coffee filters BUNN, IL, USA 20104.0006 BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator Thermo Scientific 5311-0250 Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxide Sigma, MA, USA 151882
Dialysis membrane (12-14 kDa) Spectrum Laboratories, NJ, USA 08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) Sigma, MA, USA 56064C-10L dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flask Corning, NY, USA 4980 Corning PYREX 
Ethanol VWR, PA, USA 89125-188 Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials) Corning, NY, USA 430659
Freeze dryer Labconco, MO, USA 71042000 Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powder Sigma, MA, USA G1890-5100G Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slides VWR, PA, USA 82027-788
Hotplate FOUR E'S SCIENTIFIC MI0102003 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F 
Kimwipes Fischer scientific, MA, USA 06-666
KMPR 1000 negative photoresist series Kayaku Advanced Materials, MA, USA 121619 KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLG BYK USA Inc., CT, USA 2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma, MA, USA 900889-1G >95%
Luer-Lok connector BD, NJ, USA BD 302995 
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner SÜSS MicroTeck, German Nanofabrication device
Methacylate anhydride Sigma, MA, USA 276685-100ML contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q water Millipore Corporation, MA, USA ZRQSVR5WW electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid 3M, MN, USA 3M ID 7100003723
Oven VWR, PA, USA VWR-1410 1410 Vacuum Oven
Parafilm Fischer scientific, MA, USA HS234526C
Pasteur pipette VWR, PA, USA 14673-010
Petri dish VWR, PA, USA 25384-092 polystyrene
Pico-Surf Sphere Fluidics, UK C022 (5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette VWR, PA, USA 89079-970
Pipette tips VWR, PA, USA 87006-060
Plasma cleaner chamber Harrick Plasma, NY, USA PDC-001-HP 
Polydimethylsiloxane Dow Corning, MI, USA  2065623 SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipette Microman E M100E, Gilson, OH, USA M100E
Silicon wafers UniversityWafer, MA, USA 452/1196 4-inch mechanical grade
Spatula VWR, PA, USA 231-0104 Disposable
SU-8  Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pump Harvard Apparatus, MA, USA 70-2001 PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Millipore Sigma, MA, USA 448931-10G 97%
Tygon tubings Saint-globain, PA, USA AAD04103 
UV light  QUANS Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unit VWR, PA, USA 10040-460 0.20 µm
Vortex Fischer scientific, USA 14-955-151 Mini Vortex Mixer

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Ataie, Z., Jaberi, A., Kheirabadi, S., Risbud, A., Sheikhi, A. Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (190), e64829, doi:10.3791/64829 (2022).

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