Summary

Andamios de hidrogel granular de metacriloilo de gelatina: fabricación de microgel de alto rendimiento, liofilización, ensamblaje químico y bioimpresión 3D

Published: December 09, 2022
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Summary

Este artículo describe los protocolos para la fabricación de microgel de metacriloilo de gelatina de alto rendimiento utilizando dispositivos microfluídicos, la conversión de microgeles en polvo resuspendible (micro-aerogeles), el ensamblaje químico de microgeles para formar andamios de hidrogel granular y el desarrollo de biotintas de hidrogel granular con microporosidad preservada para bioimpresión 3D.

Abstract

La aparición de andamios de hidrogel granular (GHS), fabricados mediante el ensamblaje de micropartículas de hidrogel (HMP), ha permitido la formación de andamios microporosos in situ. A diferencia de los hidrogeles a granel convencionales, los poros interconectados a microescala en GHS facilitan la infiltración celular independiente de la degradación, así como la transferencia de oxígeno, nutrientes y subproductos celulares. La gelatina modificada con metacriloilo (GelMA), un biopolímero a base de proteínas (foto)químicamente reticulado que contiene adhesivo celular y restos biodegradables, se ha utilizado ampliamente como biomaterial instructivo / sensible a las células. La conversión de GelMA a granel a GHS puede abrir una gran cantidad de oportunidades para la ingeniería y regeneración de tejidos. En este artículo, demostramos los procedimientos de fabricación de microgel GelMA de alto rendimiento, conversión a microgeles secos resuspendibles (micro-aerogeles), formación de GHS a través del ensamblaje químico de microgeles y fabricación de biotinta granular para bioimpresión por extrusión. Mostramos cómo un tratamiento fisicoquímico secuencial a través de enfriamiento y fotoreticulación permite la formación de GHS mecánicamente robusto. Cuando la luz es inaccesible (por ejemplo, durante la inyección de tejido profundo), los HMP de GelMA reticulados individualmente pueden ensamblarse bioortogonalmente a través de la reticulación enzimática utilizando transglutaminasas. Finalmente, la bioimpresión tridimensional (3D) de GHS microporoso a baja densidad de empaquetamiento HMP se demuestra a través del autoensamblaje interfacial de nanopartículas cargadas heterogéneamente.

Introduction

El ensamblaje de bloques de construcción HMP para formar andamios de ingeniería de tejidos ha ganado una gran atención en los últimos años1. GHS, fabricado a través del ensamblaje HMP, tiene propiedades únicas en comparación con sus contrapartes a granel, incluida la microporosidad a escala celular que se origina en los espacios vacíos entre los bloques de construcción discretos. Las propiedades adicionales, como la inyectabilidad, la modularidad y la rigidez desacoplada de la porosidad, hacen de GHS una plataforma prometedora para mejorar la reparación y regeneración de tejidos2. Se han utilizado diferentes biomateriales para la fabricación de GHS, incluidos polímeros sintéticos basados en PEG3,4 y polisacáridos, como el alginato5 y el ácido hialurónico 6,7. Entre los polímeros de origen natural, el biopolímero a base de proteínas más común para la fabricación de GHS es GelMA 8,9,10,11, un biomaterial reticulado, biocompatible, bioadhesivo y biodegradable 12,13.

Los HMP pueden fabricarse mediante emulsificación por lotes8, dispositivos microfluídicos de concentración de flujo 14,15 o emulsificación escalonada9,11, mezcla 16 o coacervación compleja17,18. Por lo general, existe una compensación entre el rendimiento de fabricación y la monodispersión de HMP. Por ejemplo, la técnica de mezcla produce HMP de forma irregular y altamente polidispersos. La emulsificación por lotes o la coacervación compleja permiten la producción de grandes volúmenes de HMP esféricas polidispersas. Los dispositivos microfluídicos de enfoque de flujo se han utilizado para fabricar gotas altamente monodispersas con un coeficiente de variación del <5%, sin embargo, el rendimiento es significativamente bajo. En los dispositivos microfluídicos de emulsificación escalonada, los pasos altamente paralelizados permiten la fabricación de alto rendimiento de HMP monodispersos19.

Los bloques de construcción HMP de gelatina modificada con metacriloilo (GelMA) son termosensibles y (foto) reticulables químicamente, lo que permite una fácil fabricación GHS20. Al enfriarse por debajo de la temperatura superior de la solución crítica (UCST)21 (por ejemplo, a 4 °C), las gotas que contienen una solución de GelMA se convierten en HMP reticuladas físicamente. Estos bloques de construcción de HMP se empaquetan utilizando fuerzas externas (por ejemplo, mediante centrifugación) para producir suspensiones de microgel atascadas. Los enlaces entre partículas se establecen entre HMP adyacentes a través de reticulación (foto)química para formar GHS14 mecánicamente robusto. Una de las propiedades más importantes del GHS es la microporosidad, lo que permite una fácil penetración celular in vitro11 y un mayor crecimiento tisular in vivo22. La bioimpresión tridimensional (3D) de HMP se realiza convencionalmente utilizando suspensiones de microgel apretadas, comprometiendo la microporosidad23.

Recientemente hemos desarrollado una nueva clase de biotintas granulares basadas en la nanoingeniería interfacial de microgeles GelMA a través de la adsorción de nanopartículas cargadas heterogéneamente, seguidas de autoensamblaje reversible de nanopartículas. Esta estrategia hace que los microgeles sueltos producidos por cizallamiento y extrusión sean bioimprimibles en 3D, lo que preserva la porosidad a microescala del GHS11 fabricado aditivamente. Este artículo presenta los métodos para la fabricación de gotas GelMA de alto rendimiento, la conversión de estas gotas en HMP reticuladas físicamente, la fabricación de HMP GelMA utilizando polvo resuspendible, la formación de GelMA GHS, la preparación de biotinta granular (NGB) de nanoingeniería GelMA y la bioimpresión 3D.

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo. 1. Síntesis de GelMA NOTA: La síntesis de GelMA debe realizarse en una campana extractora de humos químicos, y se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado todo el tiempo. Añadir 200 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, 1x) …

Representative Results

GelMA se sintetizó a través de la reacción de gelatina con MA, como se presenta en la Figura 1A. Al adaptar las condiciones de reacción, como la concentración de MA, se obtuvieron diferentes grados de sustitución de MA. Para cuantificar el grado de sustitución de MA, se evaluó GelMA mediante espectroscopia de RMN 1H (Figura 1B). Los grupos funcionales de vinilo con picos representativos en los cambios químicos de ~ 5-6 ppm confirmar…

Discussion

La gelatina y sus derivados son los biomateriales a base de proteínas más utilizados para la fabricación de HMP. El desafío del equilibrio entre el rendimiento y la monodispersidad del tamaño de partícula se puede superar utilizando dispositivos microfluídicos de emulsificación escalonada. Estos dispositivos son capaces de formar más de 40 millones de gotas por hora, con un coeficiente de variación inferior al 5%27. En este artículo, discutimos la microfabricación de gotas que contiene…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a T. Pond, especialista en apoyo a la investigación en el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad Estatal de Pensilvania (Penn State), al personal del Laboratorio de Nanofabricación de Penn State y al Dr. J. de Rutte de Partillion Bioscience por la ayuda y la discusión sobre los procesos de nanofabricación. A. Sheikhi reconoce el apoyo de las subvenciones iniciales del Instituto de Investigación de Materiales (MRI) y la Facultad de Ingeniería de Materiales Materiales Materia a Nivel Humano, el Centro de Convergencia para Sistemas de Materiales Multifuncionales Vivos (LiMC2) y el Programa de Subvenciones de Investigación Colaborativa de Materiales Vivos, Adaptativos y Energéticamente Autónomos del Clúster de Excelencia (livMatS) y el fondo de inicio de Penn State. La investigación reportada en esta publicación fue parcialmente apoyada por el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (NIBIB) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio R56EB032672.

Materials

1H,1H-perfluoro-1-octanol Alfa Aesar, MA, USA B20156-18 98% purity
Biopsy punch Integra Miltex, NY, USA 33-31A-P/25 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needle SANANTS 30-002-25 25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz 400 MHz Bruker NEO, MA, USA NMR device
Centrifuge Eppendorf, Germany 5415 C
Centrifuge tube Celltreat, MA ,USA 229423
Coffee filters BUNN, IL, USA 20104.0006 BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator Thermo Scientific 5311-0250 Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxide Sigma, MA, USA 151882
Dialysis membrane (12-14 kDa) Spectrum Laboratories, NJ, USA 08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) Sigma, MA, USA 56064C-10L dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flask Corning, NY, USA 4980 Corning PYREX 
Ethanol VWR, PA, USA 89125-188 Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials) Corning, NY, USA 430659
Freeze dryer Labconco, MO, USA 71042000 Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powder Sigma, MA, USA G1890-5100G Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slides VWR, PA, USA 82027-788
Hotplate FOUR E'S SCIENTIFIC MI0102003 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F 
Kimwipes Fischer scientific, MA, USA 06-666
KMPR 1000 negative photoresist series Kayaku Advanced Materials, MA, USA 121619 KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLG BYK USA Inc., CT, USA 2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma, MA, USA 900889-1G >95%
Luer-Lok connector BD, NJ, USA BD 302995 
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner SÜSS MicroTeck, German Nanofabrication device
Methacylate anhydride Sigma, MA, USA 276685-100ML contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q water Millipore Corporation, MA, USA ZRQSVR5WW electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid 3M, MN, USA 3M ID 7100003723
Oven VWR, PA, USA VWR-1410 1410 Vacuum Oven
Parafilm Fischer scientific, MA, USA HS234526C
Pasteur pipette VWR, PA, USA 14673-010
Petri dish VWR, PA, USA 25384-092 polystyrene
Pico-Surf Sphere Fluidics, UK C022 (5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette VWR, PA, USA 89079-970
Pipette tips VWR, PA, USA 87006-060
Plasma cleaner chamber Harrick Plasma, NY, USA PDC-001-HP 
Polydimethylsiloxane Dow Corning, MI, USA  2065623 SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipette Microman E M100E, Gilson, OH, USA M100E
Silicon wafers UniversityWafer, MA, USA 452/1196 4-inch mechanical grade
Spatula VWR, PA, USA 231-0104 Disposable
SU-8  Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pump Harvard Apparatus, MA, USA 70-2001 PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Millipore Sigma, MA, USA 448931-10G 97%
Tygon tubings Saint-globain, PA, USA AAD04103 
UV light  QUANS Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unit VWR, PA, USA 10040-460 0.20 µm
Vortex Fischer scientific, USA 14-955-151 Mini Vortex Mixer

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Ataie, Z., Jaberi, A., Kheirabadi, S., Risbud, A., Sheikhi, A. Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (190), e64829, doi:10.3791/64829 (2022).

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