Die Methodik beschreibt die Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) und deren Anwendung für die In-vitro-Evaluierung von Antigenkandidaten während der Entwicklung potenzieller veterinärmedizinischer Impfstoffe bei Rindern.
Dendritische Zellen (DCs) sind die potentesten antigenpräsentierenden Zellen (APCs) innerhalb des Immunsystems. Sie patrouillieren den Organismus auf der Suche nach Krankheitserregern und spielen eine einzigartige Rolle innerhalb des Immunsystems, indem sie die angeborene und die adaptive Immunantwort miteinander verbinden. Diese Zellen können phagozytieren und dann eingefangene Antigene den Effektor-Immunzellen präsentieren, was eine Vielzahl von Immunreaktionen auslöst. Diese Arbeit demonstriert eine standardisierte Methode zur In-vitro-Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs), die aus mononukleären Zellen (PBMCs) des peripheren Blutes von Rindern isoliert wurden, und ihre Anwendung bei der Bewertung der Immunogenität von Impfstoffen.
Die magnetische Zellsortierung wurde verwendet, um CD14+-Monozyten aus PBMCs zu isolieren, und die Supplementierung des kompletten Nährmediums mit Interleukin (IL)-4 und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) wurde verwendet, um die Differenzierung von CD14+-Monozyten in naive MoDCs zu induzieren. Die Generierung unreifer MoDCs wurde durch den Nachweis der Expression von Major Histocompatibility Complex II (MHC II), CD86 und CD40 Zelloberflächenmarkern bestätigt. Ein kommerziell erhältlicher Tollwutimpfstoff wurde verwendet, um die unreifen MoDCs zu pulsieren, die anschließend mit naiven Lymphozyten kokultiviert wurden.
Die durchflusszytometrische Analyse der antigengepulsten MoDCs und der Lymphozyten-Cokultur ergab die Stimulation der T-Lymphozytenproliferation durch die Expression von Ki-67-, CD25-, CD4- und CD8-Markern. Die Analyse der mRNA-Expression von IFN-γ und Ki-67 mittels quantitativer PCR zeigte, dass die MoDCs das antigenspezifische Priming von Lymphozyten in diesem in vitro Co-Kultursystem induzieren können. Darüber hinaus zeigte die mittels ELISA untersuchte IFN-γ-Sekretion einen signifikant höheren Titer (**p < 0,01) in der Tollwut-Impfstoff-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur als in der nicht-antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur. Diese Ergebnisse zeigen die Validität dieses In-vitro-MoDC-Assays zur Messung der Immunogenität von Impfstoffen, was bedeutet, dass dieser Assay verwendet werden kann, um potenzielle Impfstoffkandidaten für Rinder zu identifizieren, bevor mit In-vivo-Studien fortgefahren wird, sowie bei der Bewertung der Immunogenität von Impfstoffen kommerzieller Impfstoffe.
Tierärztliche Impfungen stellen einen entscheidenden Aspekt der Tierhaltung und -gesundheit dar, da sie zur Verbesserung der Ernährungssicherheit und des Tierwohls beitragen, indem sie Schutz vor Krankheiten bieten, die den Viehzuchtsektor weltweit betreffen1. Eine wirksame In-vitro-Methode zur Beurteilung der Immunogenität möglicher Impfstoffkandidaten würde dazu beitragen, den Prozess der Impfstoffentwicklung und -produktion zu beschleunigen. Es ist daher notwendig, das Feld der Immuntests mit innovativen Methoden auf der Grundlage von In-vitro-Studien zu erweitern, da dies dazu beitragen würde, die Komplexität der Immunprozesse im Zusammenhang mit Immunisierung und Erregerinfektion aufzudecken. Derzeit werden In-vivo-Immunisierungs- und Provokationsstudien an Tieren, die regelmäßige Probenahmen (z. B. Blut und Milz) erfordern, verwendet, um die Immunogenität von Impfstoffkandidaten und Adjuvantien zu messen. Diese Tests sind teuer, zeitaufwändig und haben ethische Implikationen, da in den meisten Fällen die Euthanasie der Tiere am Ende der Studien durchgeführt wird.
Als Alternative zu In-vivo-Assays wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) verwendet, um impfstoffinduzierte Immunantworten in vitrozu untersuchen 2. PBMCs sind eine heterogene Zellpopulation, die sich zu 70 % bis 90 % aus Lymphozyten, zu 10 % aus Monozyten und einer begrenzten Anzahl von dendritischen Zellen (DCs, 1 % bis 2 %) zusammensetzt3. PBMCs beherbergen antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie B-Zellen, Monozyten und DCs, die den Organismus ständig auf der Suche nach Anzeichen von Infektionen oder Gewebeschäden patrouillieren. Lokal sezernierte Chemokine erleichtern die Rekrutierung und Aktivierung von APCs an diesen Stellen, indem sie an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Im Falle von Monozyten lenken Chemokine ihr Schicksal darauf, sich entweder in DCs oder Makrophagen zu differenzieren4. Sobald DCs auf einen Erreger treffen und ihn einfangen, wandern sie zu sekundären lymphatischen Organen, wo sie die prozessierten Pathogenpeptidantigene mit Hilfe von MHC-Oberflächenproteinen der Klasse I oder II CD8+ T-Zellen bzw. CD4+ T-Zellen präsentieren und so eine Immunantwort auslösenkönnen 5,6.
Die Schlüsselrolle, die DCs bei der Orchestrierung einer schützenden Immunantwort gegen verschiedene Krankheitserreger spielen, macht sie zu einem interessanten Forschungsziel für das Verständnis intrazellulärer Immunmechanismen, insbesondere bei der Entwicklung von Impfstoffen und Adjuvantien gegen Infektionserreger7. Da der Anteil der DCs, die aus PBMCs gewonnen werden können, eher gering ist (1%-2%), wurden stattdessen Monozyten verwendet, um DCs in vitro zu erzeugen 8. Diese von Monozyten abgeleiteten DCs (MoDCs) wurden zunächst als mögliche Behandlungsstrategie in der Krebsimmuntherapie entwickelt9. In jüngerer Zeit wurden MoDCs für die Impfstoffforschung verwendet 10,11,12, und klassische Monozyten sind der vorherrschende Subtyp (89 %) für die MoDC-Produktion 13. Die Herstellung von MoDCs in vitro wurde zuvor durch die Zugabe von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) in Kombination mit anderen Zytokinen wie Interleukin-4 (IL-4), Tumornekrosefaktor α (TNF-α) oder IL-13erreicht 14,15,16.
Der Erfolg eines In-vitro-MoDC-Assays hängt von der Fähigkeit antigenstimulierter reifer MoDCs ab, das Ausmaß und die Art der Immunantwort spezifisch für die Art des nachgewiesenen Antigens zu modulieren17. Die Art des Erregers, der von MoDCs erkannt und präsentiert wird, bestimmt die Differenzierung von CD4+ T-Helferzellen (Th) in Th1-, Th2- oder Th17-Effektorzellen und ist durch ein pathogenspezifisches sekretorisches Zytokinprofil gekennzeichnet. Eine Th1-Antwort wird gegen intrazelluläre Pathogene hervorgerufen und führt zur Sekretion von Interferon-gamma (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor beta (TNF-β), was den phagozytischen Schutz moduliert. Eine Th2-Antwort wird gegen parasitäre Organismen ausgelöst und ist durch die Sekretion von IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 gekennzeichnet, die einen phagozytisch-unabhängigen humoralen Schutz initiiert. Th17 bietet einen neutrophilenabhängigen Schutz vor extrazellulären Bakterien- und Pilzinfektionen, die durch die Sekretion von IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 und TNF-α 18,19,20,21 vermittelt werden. Aufgrund früherer Studien wurde festgestellt, dass nicht alle Erreger innerhalb des erwarteten Zytokinprofils liegen. Zum Beispiel stimulieren dermale MoDCs als Reaktion auf eine parasitäre Leishmanieninfektion die IFN-γ Sekretion von CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen und induzieren so eine proinflammatorische Th1-Antwort22.
Es wurde auch gezeigt, dass MoDCs von Hühnern, die mit Salmonella-Lipopolysaccharid (LPS) geprimt wurden, eine variable Antwort gegen Salmonella typhimurium induzieren können, indem sie sowohl Th1- als auch Th2-Antworten aktivieren, während Salmonella gallinarum allein eine Th2-Antwort induziert, was die höhere Resistenz des letzteren gegenüber der MoDC-Clearanceerklären könnte 23. Die Aktivierung von MoDCs gegen Brucella canis (B. canis) wurde sowohl bei Hunden als auch bei menschlichen MoDCs berichtet, was bedeutet, dass dies einen zoonotischen Infektionsmechanismus darstellen könnte24. Humane MoDCs, die mit B. canis geprimt sind, induzieren eine starke Th1-Antwort, die eine Resistenz gegen schwere Infektionen verleiht, während canine MoDCs eine dominante Th17-Antwort mit einer reduzierten Th1-Antwort induzieren, was in der Folge zur Etablierung einer chronischen Infektion führt25. Bovine MoDCs zeigen eine erhöhte Affinität für das Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV), das mit Immunglobulin G (IgG) konjugiert ist, im Vergleich zu nicht-konjugierten FMDV allein, da die MoDCs als Antwort auf die erstgenannten einen Virus-Antikörper-Komplex bilden10. Zusammenfassend zeigen diese Studien, wie MoDCs verwendet wurden, um die Komplexität von Immunantworten während der Infektion mit Krankheitserregern zu analysieren. Die adaptiven Immunantworten können durch die Quantifizierung spezifischer Marker bewertet werden, die mit der Proliferation von Lymphozyten assoziiert sind. Ki-67, ein intrazelluläres Protein, das nur in sich teilenden Zellen nachgewiesen wird, gilt als zuverlässiger Marker für Proliferationsstudien26, und in ähnlicher Weise entspricht CD25, das während der späten Phase der Aktivierung auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert wird, der Proliferation von Lymphozyten27,28.
Diese Studie demonstriert eine standardisierte Methode zur In-vitro-Generierung von Rinder-MoDCs und deren Anwendung in einem In-vitro-Immunassay, der zur Prüfung der Immunogenität von Impfstoffen verwendet wird. Ein kommerziell erhältlicher Tollwutimpfstoff (RV) wurde verwendet, um die Wirksamkeit dieses Tests zu validieren. Die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten wurde mittels Durchflusszytometrie, quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) durch die Analyse etablierter Zellaktivierungsmarker wie Ki-67 und CD25 und der Sekretion von IFN-γ 28,29,30,31 gemessen. Während des MoDC-Assays werden keine Tier- oder Humanversuche durchgeführt.
Diese Studie demonstriert eine standardisierte In-vitro-Methode zur Generierung und Phänotypisierung von bovinen MoDCs und deren anschließende Verwendung zur Messung der Immunogenität eines kommerziellen Impfstoffs (z. B. RV). Rinder-MoDCs können als Werkzeug für das Screening potenzieller Impfantigene gegen Rinderkrankheiten und die Vorhersage ihrer potenziellen klinischen Auswirkungen auf der Grundlage von Immunreaktionen verwendet werden, bevor mit In-vivo-Tierversuchen fortgefahren wird. Die ge…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Eveline Wodak und Dr. Angelika Loistch (AGES) für ihre Unterstützung bei der Bestimmung des Gesundheitszustands der Tiere und für die Bereitstellung von BTV, Dr. Bernhard Reinelt für die Bereitstellung von Rinderblut und Dr. Bharani Settypalli und Dr. William Dundon von der IAEO für nützliche Ratschläge zu den Real-Time-PCR-Experimenten bzw. zur Sprachbearbeitung.
ACK Lysing Buffer | Gibco, Thermo Fisher | A1049201 | Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction |
BD Vacutainer Heparin Tubes | Becton, Dickinson (BD) and Company | 366480 | 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size |
Bovine Dendritic Cell Growth Kit | Bio-Rad, UK | PBP015KZZ | Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF |
Bovine IFN-γ ELISA Kit | Bio-Rad | MCA5638KZZ | Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant |
CD14 Antibody | Bio-Rad | MCA2678F | Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1 |
CD25 Antibody | Bio-Rad | MCA2430PE | Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1 |
CD4 Antibody | Bio-Rad | MCA1653A647 | Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a |
CD40 Antibody | Bio-Rad | MCA2431F | Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1 |
CD8 Antibody | Bio-Rad | MCA837F | Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a |
CD86 Antibody | Bio-Rad | MCA2437PE | Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1 |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | – | Thermal cycler PCR machine |
Corning Centrifuge Tube | Falcon Corning | 352096 & 352070 | 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube |
Cytofix/Cytoperm Plus | BD Bio Sciences | 555028 | Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining |
Ethanol | Sigma Aldrich | 1009832500 | Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher | 10500064 | Qualified, heat inactivated |
Ficoll Plaque PLUS | GE Health care Life Sciences, USA | 341691 | Lymphocyte-isolation medium |
FlowClean Cleaning Agent | Beckman Coulter, Life Sciences | A64669 | 500 mL |
FlowJo | FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA | – | Flow cytometer Histogram software |
FlowTubes/ FACS (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube | Falcon Corning | 352235 | 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis |
Fluoresceinisothiocynat-Dextran | Sigma Aldrich, Germany | 60842-46-8 | FITC-dextran MW |
Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | – | Flow cytometer machine |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | HSP9601 | 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear |
Human CD14 MicroBeads | Miltenyi Bioteck, Germany | 130-050-201 | 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs |
Kaluza | Beckman Coulter, Germany | – | Flow cytometer multicolor data analysis software |
MACS Column | Miltenyi Bioteck, Germany | 130-042-401 | Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens |
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody | Bio-Rad | MCA2228F | Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine |
Microcentrifuge Tube | Sigma Aldrich | HS4325 | 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube |
Microsoft Power Point | Microsoft | – | The graphical illustrations of experimental design |
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody | Bio-Rad | MCA928F | Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody |
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody | Bio-Rad | MCA928PE | Isotype control CD86 monoclonal antibody |
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody | Bio-Rad | MCA928PE | Isotype control CD25 monoclonal antibody |
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody | Bio-Rad | MCA929F | Isotype control for MHC class II monoclonal antibody |
Nobivac Rabies | MSD Animal Health, UK | – | 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain |
Optical seals | Bi0-Rad | TCS0803 | 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine |
Penicillin-Streptomycin | Gibco, Thermo Fisher | 15140122 | 100 mL |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Thermo Fisher | 10010023 | pH 7.4, 1x concentration |
Prism – GraphPad 5 Software | Dotmatics | – | Statistical software |
Purified Anti-human Ki-67 antibody | Biolegend, USA | 350501 | Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67 |
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400101 | Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody |
READIDROP Propidium Iodide | BD Bio Sciences | 1351101 | Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye |
Recombinant Human IL-2 Protein | R&D System, USA | 202-IL-010/CF | Interleukin-2, 20 ng/ml |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor. |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R8758 | Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate |
SMART-servier medical art | Les Laboratories Servier | – | Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5270 | 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes. |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen, Thermo Fisher | 18080051 | Kit for cDNA synthsis |
Tissue Culture Test plate 24 | TPP, Switzerland | 92024 | 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL |
Trypan Blue Solution | Gibco, Thermo Fisher | 15250061 | 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen, Thermo Fisher | 10977023 | 0.1 µm membrane filtered distilled water |
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes | Thermo Fisher Scientific | 15206067 | VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample. |
Water | Sigma Aldrich | W3500-1L | Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture |