Методология описывает генерацию дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота (MoDC), и их применение для оценки in vitro антигенных кандидатов при разработке потенциальных ветеринарных вакцин для крупного рогатого скота.
Дендритные клетки (ДК) являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками (АПК) в иммунной системе. Они патрулируют организм в поисках патогенов и играют уникальную роль в иммунной системе, связывая врожденные и адаптивные иммунные реакции. Эти клетки могут фагоцитировать, а затем представлять захваченные антигены эффекторным иммунным клеткам, вызывая широкий спектр иммунных реакций. В этой статье демонстрируется стандартизированный метод получения in vitro дендритных клеток (MoDC) из моноцитов крупного рогатого скота, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови крупного рогатого скота (PBMC), и их применение для оценки иммуногенности вакцины.
Магнитная сортировка клеток использовалась для выделения моноцитов CD14+ из PBMC, а добавление полной питательной среды интерлейкином (IL)-4 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) использовалось для индукции дифференцировки моноцитов CD14+ в наивные MoDC. Генерация незрелых MoDC была подтверждена детекцией экспрессии основных маркеров клеточной поверхности комплекса гистосовместимости II (MHC II), CD86 и CD40. Коммерчески доступная вакцина против бешенства использовалась для импульсирования незрелых MoDC, которые впоследствии культивировались совместно с наивными лимфоцитами.
Анализ проточной цитометрии антиген-импульсных MoDC и кокультуры лимфоцитов выявил стимуляцию пролиферации Т-лимфоцитов за счет экспрессии маркеров Ki-67, CD25, CD4 и CD8. Анализ экспрессии мРНК ИФН-γ и Ki-67 с помощью количественной ПЦР показал, что MoDC могут индуцировать антиген-специфический прайминг лимфоцитов в этой системе кокультурирования in vitro . Кроме того, секреция ИФН-γ, оцененная с помощью ИФА, показала значительно более высокий титр (**p < 0,01) в кокультуре MoDC-лимфоцитов с импульсной вакциной против бешенства, чем в кокультуре неантиген-импульсных MoDC-лимфоцитов. Эти результаты показывают достоверность этого анализа in vitro MoDC для измерения иммуногенности вакцины, что означает, что этот анализ может быть использован для выявления потенциальных кандидатов на вакцину для крупного рогатого скота, прежде чем приступить к испытаниям in vivo , а также при оценке иммуногенности вакцин коммерческих вакцин.
Ветеринарная вакцинация представляет собой важнейший аспект животноводства и здравоохранения, поскольку она способствует повышению продовольственной безопасности и благополучия животных, обеспечивая защиту от болезней, поражающих животноводческий сектор во всем мире1. Эффективный метод in vitro для оценки иммуногенности возможных вакцин-кандидатов поможет ускорить процесс разработки и производства вакцины. Поэтому необходимо расширить область иммунных анализов инновационными методологиями, основанными на исследованиях in vitro , поскольку это поможет раскрыть сложность иммунных процессов, связанных с иммунизацией и патогенной инфекцией. В настоящее время для измерения иммуногенности вакцин-кандидатов и адъювантов используются иммунизация животных in vivo , которые требуют периодического отбора проб (например, крови и селезенки). Эти анализы являются дорогостоящими, трудоемкими и имеют этические последствия, потому что в большинстве случаев эвтаназия животных проводится к концу испытаний.
В качестве альтернативы анализам in vivo мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) использовались для оценки иммунных реакций, индуцированных вакциной, in vitro2. PBMC представляют собой гетерогенную популяцию клеток, состоящую из 70-90% лимфоцитов, 10-20% моноцитов и ограниченного числа дендритных клеток (DC, 1-2%)3. PBMC содержат антигенпрезентирующие клетки (APC), такие как В-клетки, моноциты и ДК, которые постоянно патрулируют организм в поисках признаков инфекции или повреждения тканей. Локально секретируемые хемокины облегчают рекрутирование и активацию APC в этих участках путем связывания с рецепторами клеточной поверхности. В случае моноцитов хемокины направляют свою судьбу либо на дифференцировку в ДК, либо на макрофаги4. Как только ДК сталкиваются с патогеном и захватывают его, они мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где они могут представить обработанные пептидные антигены патогена с использованием поверхностных белков основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II CD8+ Т-клеткам CD8+ или CD4+ Т-клеткам, соответственно, вызывая иммунный ответ 5,6.
Ключевая роль, которую играют ДК в организации защитного иммунного ответа против различных патогенов, делает их интересной исследовательской мишенью для понимания внутриклеточных иммунных механизмов, особенно при разработке вакцин и адъювантов против инфекционных агентов7. Поскольку доля ДК, которые могут быть получены из PBMC, довольно мала (1% -2%), моноциты вместо этого использовались для генерации ДК in vitro8. Эти моноцитарные ДК (MoDC) были первоначально разработаны в качестве возможной стратегии лечения в иммунотерапии рака9. Совсем недавно MoDC использовались для исследований вакцин 10,11,12, а классические моноциты являются преобладающим подтипом (89%) для производства MoDC 13. Продуцирование MoDC in vitro ранее достигалось путем добавления гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), вводимого в сочетании с другими цитокинами, такими как интерлейкин-4 (IL-4), фактор некроза опухоли α (TNF-α) или IL-1314,15,16.
Успех анализа MoDC in vitro зависит от способности стимулированных антигеном зрелых MoDC модулировать степень и тип иммунного ответа, специфичного для типа обнаруженного антигена17. Тип патогена, распознаваемый и представленный MoDC, определяет дифференцировку CD4+ Т-хелперных (Th) клеток в эффекторные клетки Th1, Th2 или Th17 и характеризуется патоген-специфическим секреторным цитокиновым профилем. Ответ Th1 вызывается против внутриклеточных патогенов и приводит к секреции интерферона-гамма (ИФН-γ) и фактора некроза опухоли бета (ФНО-β), который модулирует фагоцитарно-зависимую защиту. Ответ Th2 запускается против паразитических организмов и характеризуется секрецией IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13, которая инициирует фагоцитарно-независимую гуморальную защиту. Th17 обеспечивает нейтрофил-зависимую защиту от внеклеточных бактериальных и грибковых инфекций, опосредованных секрецией IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 и TNF-α 18,19,20,21. Основываясь на предыдущих исследованиях, было отмечено, что не все патогены попадают в ожидаемый цитокиновый профиль. Например, кожные МДК в ответ на паразитарную инфекцию лейшмании стимулируют секрецию ИФН-γ из CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток, тем самым индуцируя защитный провоспалительный ответ Th122.
Также было показано, что у куриных МДК, заправленных липополисахаридом сальмонеллы (ЛПС), может индуцировать переменный ответ против Salmonella typhimurium, активируя как Th1, так и Th2 ответы, тогда как Salmonella gallinarum индуцирует только ответ Th2, что может объяснить более высокую резистентность последних к клиренсуMoDC 23. Активация MoDC против Brucella canis (B. canis) также была зарегистрирована как у собак, так и у человека, что означает, что это может представлять собой механизм зоонозной инфекции24. MoDC человека, примированные B. canis, индуцируют сильный ответ Th1, который придает устойчивость к тяжелой инфекции, тогда как MoDC собак индуцируют доминирующий ответ Th17 со сниженным ответом Th1, что впоследствии приводит к установлению хронической инфекции25. MoDC крупного рогатого скота демонстрируют повышенное сродство к вирусу ящура (FMDV), конъюгированному с иммуноглобулином G (IgG), по сравнению с одним неконъюгированным ящуром, поскольку MoDC образуют комплекс вирус-антитело в ответ на первые10. Взятые вместе, эти исследования показывают, как MoDC использовались для анализа сложности иммунных реакций во время патогенной инфекции. Адаптивные иммунные реакции могут быть оценены путем количественного определения специфических маркеров, связанных с пролиферацией лимфоцитов. Ki-67, внутриклеточный белок, обнаруживаемый только в делящихся клетках, рассматривается как надежный маркер для исследований пролиферации26, и аналогичным образом CD25, экспрессируемый на поверхности Т-клеток во время поздней фазы активации, соответствует пролиферации лимфоцитов27,28.
В этом исследовании демонстрируется стандартизированный метод получения МДК крупного рогатого скота in vitro с последующим их применением в иммуноанализе in vitro, используемом для тестирования иммуногенности вакцин. Коммерчески доступная вакцина против бешенства (RV) использовалась для подтверждения эффективности этого анализа. Активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов измеряли с помощью проточной цитометрии, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) путем анализа хорошо известных маркеров активации клеток, таких как Ki-67 и CD25, и секреции ИФН-γ 28,29,30,31. Во время анализа MoDC экспериментальные испытания на животных или людях не проводятся.
Это исследование демонстрирует стандартизированный метод in vitro для получения и фенотипирования МО крупного рогатого скота и их последующего использования для измерения иммуногенности вакцины коммерческой вакцины (например, RV). MoDC крупного рогатого скота можно использовать в кач…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-ра Эвелин Водак и д-ра Анжелику Лойстч (AGES) за их поддержку в определении состояния здоровья животных и за предоставление BTV, д-ра Бернхарда Райнелта за предоставление крови крупного рогатого скота, а также д-ра Бхарани Сеттипалли и д-ра Уильяма Дандона из МАГАТЭ за полезные советы по экспериментам с ПЦР в реальном времени и редактированию языка, соответственно.
ACK Lysing Buffer | Gibco, Thermo Fisher | A1049201 | Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction |
BD Vacutainer Heparin Tubes | Becton, Dickinson (BD) and Company | 366480 | 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size |
Bovine Dendritic Cell Growth Kit | Bio-Rad, UK | PBP015KZZ | Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF |
Bovine IFN-γ ELISA Kit | Bio-Rad | MCA5638KZZ | Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant |
CD14 Antibody | Bio-Rad | MCA2678F | Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1 |
CD25 Antibody | Bio-Rad | MCA2430PE | Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1 |
CD4 Antibody | Bio-Rad | MCA1653A647 | Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a |
CD40 Antibody | Bio-Rad | MCA2431F | Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1 |
CD8 Antibody | Bio-Rad | MCA837F | Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a |
CD86 Antibody | Bio-Rad | MCA2437PE | Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1 |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | – | Thermal cycler PCR machine |
Corning Centrifuge Tube | Falcon Corning | 352096 & 352070 | 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube |
Cytofix/Cytoperm Plus | BD Bio Sciences | 555028 | Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining |
Ethanol | Sigma Aldrich | 1009832500 | Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher | 10500064 | Qualified, heat inactivated |
Ficoll Plaque PLUS | GE Health care Life Sciences, USA | 341691 | Lymphocyte-isolation medium |
FlowClean Cleaning Agent | Beckman Coulter, Life Sciences | A64669 | 500 mL |
FlowJo | FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA | – | Flow cytometer Histogram software |
FlowTubes/ FACS (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube | Falcon Corning | 352235 | 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis |
Fluoresceinisothiocynat-Dextran | Sigma Aldrich, Germany | 60842-46-8 | FITC-dextran MW |
Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | – | Flow cytometer machine |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | HSP9601 | 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear |
Human CD14 MicroBeads | Miltenyi Bioteck, Germany | 130-050-201 | 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs |
Kaluza | Beckman Coulter, Germany | – | Flow cytometer multicolor data analysis software |
MACS Column | Miltenyi Bioteck, Germany | 130-042-401 | Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens |
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody | Bio-Rad | MCA2228F | Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine |
Microcentrifuge Tube | Sigma Aldrich | HS4325 | 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube |
Microsoft Power Point | Microsoft | – | The graphical illustrations of experimental design |
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody | Bio-Rad | MCA928F | Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody |
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody | Bio-Rad | MCA928PE | Isotype control CD86 monoclonal antibody |
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody | Bio-Rad | MCA928PE | Isotype control CD25 monoclonal antibody |
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody | Bio-Rad | MCA929F | Isotype control for MHC class II monoclonal antibody |
Nobivac Rabies | MSD Animal Health, UK | – | 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain |
Optical seals | Bi0-Rad | TCS0803 | 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine |
Penicillin-Streptomycin | Gibco, Thermo Fisher | 15140122 | 100 mL |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Thermo Fisher | 10010023 | pH 7.4, 1x concentration |
Prism – GraphPad 5 Software | Dotmatics | – | Statistical software |
Purified Anti-human Ki-67 antibody | Biolegend, USA | 350501 | Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67 |
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400101 | Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody |
READIDROP Propidium Iodide | BD Bio Sciences | 1351101 | Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye |
Recombinant Human IL-2 Protein | R&D System, USA | 202-IL-010/CF | Interleukin-2, 20 ng/ml |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor. |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R8758 | Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate |
SMART-servier medical art | Les Laboratories Servier | – | Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5270 | 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes. |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen, Thermo Fisher | 18080051 | Kit for cDNA synthsis |
Tissue Culture Test plate 24 | TPP, Switzerland | 92024 | 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL |
Trypan Blue Solution | Gibco, Thermo Fisher | 15250061 | 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen, Thermo Fisher | 10977023 | 0.1 µm membrane filtered distilled water |
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes | Thermo Fisher Scientific | 15206067 | VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample. |
Water | Sigma Aldrich | W3500-1L | Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture |