Summary

Определение иммуногенности вакцины с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Методология описывает генерацию дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота (MoDC), и их применение для оценки in vitro антигенных кандидатов при разработке потенциальных ветеринарных вакцин для крупного рогатого скота.

Abstract

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками (АПК) в иммунной системе. Они патрулируют организм в поисках патогенов и играют уникальную роль в иммунной системе, связывая врожденные и адаптивные иммунные реакции. Эти клетки могут фагоцитировать, а затем представлять захваченные антигены эффекторным иммунным клеткам, вызывая широкий спектр иммунных реакций. В этой статье демонстрируется стандартизированный метод получения in vitro дендритных клеток (MoDC) из моноцитов крупного рогатого скота, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови крупного рогатого скота (PBMC), и их применение для оценки иммуногенности вакцины.

Магнитная сортировка клеток использовалась для выделения моноцитов CD14+ из PBMC, а добавление полной питательной среды интерлейкином (IL)-4 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) использовалось для индукции дифференцировки моноцитов CD14+ в наивные MoDC. Генерация незрелых MoDC была подтверждена детекцией экспрессии основных маркеров клеточной поверхности комплекса гистосовместимости II (MHC II), CD86 и CD40. Коммерчески доступная вакцина против бешенства использовалась для импульсирования незрелых MoDC, которые впоследствии культивировались совместно с наивными лимфоцитами.

Анализ проточной цитометрии антиген-импульсных MoDC и кокультуры лимфоцитов выявил стимуляцию пролиферации Т-лимфоцитов за счет экспрессии маркеров Ki-67, CD25, CD4 и CD8. Анализ экспрессии мРНК ИФН-γ и Ki-67 с помощью количественной ПЦР показал, что MoDC могут индуцировать антиген-специфический прайминг лимфоцитов в этой системе кокультурирования in vitro . Кроме того, секреция ИФН-γ, оцененная с помощью ИФА, показала значительно более высокий титр (**p < 0,01) в кокультуре MoDC-лимфоцитов с импульсной вакциной против бешенства, чем в кокультуре неантиген-импульсных MoDC-лимфоцитов. Эти результаты показывают достоверность этого анализа in vitro MoDC для измерения иммуногенности вакцины, что означает, что этот анализ может быть использован для выявления потенциальных кандидатов на вакцину для крупного рогатого скота, прежде чем приступить к испытаниям in vivo , а также при оценке иммуногенности вакцин коммерческих вакцин.

Introduction

Ветеринарная вакцинация представляет собой важнейший аспект животноводства и здравоохранения, поскольку она способствует повышению продовольственной безопасности и благополучия животных, обеспечивая защиту от болезней, поражающих животноводческий сектор во всем мире1. Эффективный метод in vitro для оценки иммуногенности возможных вакцин-кандидатов поможет ускорить процесс разработки и производства вакцины. Поэтому необходимо расширить область иммунных анализов инновационными методологиями, основанными на исследованиях in vitro , поскольку это поможет раскрыть сложность иммунных процессов, связанных с иммунизацией и патогенной инфекцией. В настоящее время для измерения иммуногенности вакцин-кандидатов и адъювантов используются иммунизация животных in vivo , которые требуют периодического отбора проб (например, крови и селезенки). Эти анализы являются дорогостоящими, трудоемкими и имеют этические последствия, потому что в большинстве случаев эвтаназия животных проводится к концу испытаний.

В качестве альтернативы анализам in vivo мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) использовались для оценки иммунных реакций, индуцированных вакциной, in vitro2. PBMC представляют собой гетерогенную популяцию клеток, состоящую из 70-90% лимфоцитов, 10-20% моноцитов и ограниченного числа дендритных клеток (DC, 1-2%)3. PBMC содержат антигенпрезентирующие клетки (APC), такие как В-клетки, моноциты и ДК, которые постоянно патрулируют организм в поисках признаков инфекции или повреждения тканей. Локально секретируемые хемокины облегчают рекрутирование и активацию APC в этих участках путем связывания с рецепторами клеточной поверхности. В случае моноцитов хемокины направляют свою судьбу либо на дифференцировку в ДК, либо на макрофаги4. Как только ДК сталкиваются с патогеном и захватывают его, они мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где они могут представить обработанные пептидные антигены патогена с использованием поверхностных белков основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II CD8+ Т-клеткам CD8+ или CD4+ Т-клеткам, соответственно, вызывая иммунный ответ 5,6.

Ключевая роль, которую играют ДК в организации защитного иммунного ответа против различных патогенов, делает их интересной исследовательской мишенью для понимания внутриклеточных иммунных механизмов, особенно при разработке вакцин и адъювантов против инфекционных агентов7. Поскольку доля ДК, которые могут быть получены из PBMC, довольно мала (1% -2%), моноциты вместо этого использовались для генерации ДК in vitro8. Эти моноцитарные ДК (MoDC) были первоначально разработаны в качестве возможной стратегии лечения в иммунотерапии рака9. Совсем недавно MoDC использовались для исследований вакцин 10,11,12, а классические моноциты являются преобладающим подтипом (89%) для производства MoDC 13. Продуцирование MoDC in vitro ранее достигалось путем добавления гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), вводимого в сочетании с другими цитокинами, такими как интерлейкин-4 (IL-4), фактор некроза опухоли α (TNF-α) или IL-1314,15,16.

Успех анализа MoDC in vitro зависит от способности стимулированных антигеном зрелых MoDC модулировать степень и тип иммунного ответа, специфичного для типа обнаруженного антигена17. Тип патогена, распознаваемый и представленный MoDC, определяет дифференцировку CD4+ Т-хелперных (Th) клеток в эффекторные клетки Th1, Th2 или Th17 и характеризуется патоген-специфическим секреторным цитокиновым профилем. Ответ Th1 вызывается против внутриклеточных патогенов и приводит к секреции интерферона-гамма (ИФН-γ) и фактора некроза опухоли бета (ФНО-β), который модулирует фагоцитарно-зависимую защиту. Ответ Th2 запускается против паразитических организмов и характеризуется секрецией IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13, которая инициирует фагоцитарно-независимую гуморальную защиту. Th17 обеспечивает нейтрофил-зависимую защиту от внеклеточных бактериальных и грибковых инфекций, опосредованных секрецией IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 и TNF-α 18,19,20,21. Основываясь на предыдущих исследованиях, было отмечено, что не все патогены попадают в ожидаемый цитокиновый профиль. Например, кожные МДК в ответ на паразитарную инфекцию лейшмании стимулируют секрецию ИФН-γ из CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток, тем самым индуцируя защитный провоспалительный ответ Th122.

Также было показано, что у куриных МДК, заправленных липополисахаридом сальмонеллы (ЛПС), может индуцировать переменный ответ против Salmonella typhimurium, активируя как Th1, так и Th2 ответы, тогда как Salmonella gallinarum индуцирует только ответ Th2, что может объяснить более высокую резистентность последних к клиренсуMoDC 23. Активация MoDC против Brucella canis (B. canis) также была зарегистрирована как у собак, так и у человека, что означает, что это может представлять собой механизм зоонозной инфекции24. MoDC человека, примированные B. canis, индуцируют сильный ответ Th1, который придает устойчивость к тяжелой инфекции, тогда как MoDC собак индуцируют доминирующий ответ Th17 со сниженным ответом Th1, что впоследствии приводит к установлению хронической инфекции25. MoDC крупного рогатого скота демонстрируют повышенное сродство к вирусу ящура (FMDV), конъюгированному с иммуноглобулином G (IgG), по сравнению с одним неконъюгированным ящуром, поскольку MoDC образуют комплекс вирус-антитело в ответ на первые10. Взятые вместе, эти исследования показывают, как MoDC использовались для анализа сложности иммунных реакций во время патогенной инфекции. Адаптивные иммунные реакции могут быть оценены путем количественного определения специфических маркеров, связанных с пролиферацией лимфоцитов. Ki-67, внутриклеточный белок, обнаруживаемый только в делящихся клетках, рассматривается как надежный маркер для исследований пролиферации26, и аналогичным образом CD25, экспрессируемый на поверхности Т-клеток во время поздней фазы активации, соответствует пролиферации лимфоцитов27,28.

В этом исследовании демонстрируется стандартизированный метод получения МДК крупного рогатого скота in vitro с последующим их применением в иммуноанализе in vitro, используемом для тестирования иммуногенности вакцин. Коммерчески доступная вакцина против бешенства (RV) использовалась для подтверждения эффективности этого анализа. Активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов измеряли с помощью проточной цитометрии, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) путем анализа хорошо известных маркеров активации клеток, таких как Ki-67 и CD25, и секреции ИФН-γ 28,29,30,31. Во время анализа MoDC экспериментальные испытания на животных или людях не проводятся.

Protocol

Забор крови осуществляется сертифицированной ветеринарной службой в соответствии с этическими принципами Австрийского агентства по здравоохранению и безопасности пищевых продуктов (AGES) и в соответствии с принятыми стандартами благополучия животных32. Исследование полу…

Representative Results

Эта методология описывает генерацию in vitro MoDC крупного рогатого скота для оценки антигенов-кандидатов вакцины перед проведением исследований in vivo. На рисунке 1 показана экспериментальная схема генерации MoDC крупного рогатого скота и применение MoDC для анализа <em…

Discussion

Это исследование демонстрирует стандартизированный метод in vitro для получения и фенотипирования МО крупного рогатого скота и их последующего использования для измерения иммуногенности вакцины коммерческой вакцины (например, RV). MoDC крупного рогатого скота можно использовать в кач…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-ра Эвелин Водак и д-ра Анжелику Лойстч (AGES) за их поддержку в определении состояния здоровья животных и за предоставление BTV, д-ра Бернхарда Райнелта за предоставление крови крупного рогатого скота, а также д-ра Бхарани Сеттипалли и д-ра Уильяма Дандона из МАГАТЭ за полезные советы по экспериментам с ПЦР в реальном времени и редактированию языка, соответственно.

Materials

ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism – GraphPad 5 Software  Dotmatics Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R., Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. , 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -. J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don’t know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -. R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz – TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118 Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005)
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  36. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  37. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  38. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  39. Cho, K. -. J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What’s the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  41. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  42. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  43. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  44. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  45. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  46. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  47. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  48. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  49. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Play Video

Cite This Article
Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

View Video