Summary

Génération et culture d’organoïdes dérivés de patients atteints d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade

Published: January 06, 2023
doi:

Summary

Les organoïdes dérivés de patients (AOP) sont une culture tridimensionnelle (3D) qui peut imiter l’environnement tumoral in vitro. Dans le cancer séreux de l’ovaire de haut grade, les AOP représentent un modèle pour étudier de nouveaux biomarqueurs et thérapeutiques.

Abstract

Les organoïdes sont des modèles tumoraux dynamiques 3D qui peuvent être cultivés avec succès à partir de tissus tumoraux ovariens dérivés de patients, d’ascites ou de liquide pleural et aident à la découverte de nouveaux traitements et biomarqueurs prédictifs du cancer de l’ovaire. Ces modèles récapitulent l’hétérogénéité clonale, le microenvironnement tumoral et les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. De plus, il a été démontré qu’ils correspondent à la tumeur primaire morphologiquement, cytologiquement, immunohistochimiquement et génétiquement. Ainsi, les organoïdes facilitent la recherche sur les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral et sont supérieurs aux lignées cellulaires. Le présent protocole décrit des méthodes distinctes pour générer des organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes à partir de tumeurs de patientes, d’ascite et d’échantillons de liquide pleural avec un taux de réussite supérieur à 97%. Les échantillons de patients sont séparés en suspensions cellulaires par digestion mécanique et enzymatique. Les cellules sont ensuite plaquées à l’aide d’un extrait de membrane basale (EMB) et sont soutenues par des milieux de croissance optimisés contenant des suppléments spécifiques à la culture du cancer de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC). Après avoir formé les organoïdes initiaux, les AOP peuvent soutenir la culture à long terme, y compris le passage pour l’expansion pour des expériences ultérieures.

Introduction

En 2021, environ 21 410 femmes aux États-Unis ont reçu un diagnostic de cancer épithélial de l’ovaire et 12 940 femmes sont décédées de cette maladie1. Bien que des progrès suffisants aient été réalisés en chirurgie et en chimiothérapie, plus de 70% des patients atteints d’une maladie avancée développent une résistance chimiothérapeutique et meurent dans les 5 ans suivant le diagnostic 2,3. Ainsi, de nouvelles stratégies pour traiter cette maladie mortelle et des modèles représentatifs et fiables pour la recherche préclinique sont nécessaires de toute urgence.

Les lignées cellulaires cancéreuses et les xénogreffes dérivées de patientes (PDX) créées à partir de tumeurs ovariennes primaires sont les principaux instruments utilisés dans la recherche sur le cancer de l’ovaire. Un avantage majeur des lignées cellulaires cancéreuses est leur expansion rapide. Cependant, leur culture continue entraîne des altérations phénotypiques et génotypiques qui font que les lignées cellulaires cancéreuses s’écartent de l’échantillon original de tumeur cancéreuse primaire. En raison des différences existantes entre la lignée cellulaire cancéreuse et la tumeur primaire, les tests de médicaments qui ont des effets positifs dans les lignées cellulaires ne parviennent pas à avoir ces mêmes effets dans les essais cliniques2. Pour surmonter ces limitations, des modèles PDX sont utilisés. Ces modèles sont créés en implantant du tissu frais de cancer de l’ovaire chez des souris immunodéficientes. Comme il s’agit de modèles in vivo , ils ressemblent plus précisément aux caractéristiques biologiques humaines et, à leur tour, sont plus prédictifs des résultats des médicaments. Cependant, ces modèles présentent également des limites importantes, notamment le coût, le temps et les ressources nécessaires pour les générer4.

Les AOP offrent un modèle alternatif pour la recherche préclinique qui surmonte les limites des lignées cellulaires cancéreuses et des modèles PDX. Les AOP récapitulent la tumeur et le microenvironnement tumoral d’un patient et, ainsi, fournissent un modèle traitable in vitro idéal pour la recherche préclinique 2,3,5. Ces modèles 3D ont des capacités d’auto-organisation qui modélisent la tumeur primaire, une caractéristique que leurs homologues de lignées cellulaires bidimensionnelles (2D) ne possèdent pas. En outre, il a été démontré que ces modèles représentent génétiquement et fonctionnellement leurs tumeurs parentes et, par conséquent, sont des modèles fiables pour l’étude de nouveaux processus thérapeutiques et biologiques. En bref, ils offrent des capacités d’expansion et de stockage à long terme similaires aux lignées cellulaires, mais englobent également le microenvironnement et les interactions cellule-cellule inhérents aux modèles murins 4,6.

Le présent protocole décrit la création d’AOP à partir de tumeurs dérivées de patients, d’ascite et d’échantillons de liquide pleural avec un taux de réussite supérieur à 97%. Les cultures AOP peuvent ensuite être étendues à plusieurs générations et utilisées pour tester la sensibilité au traitement médicamenteux et les biomarqueurs prédictifs. Cette méthode représente une technique qui pourrait être utilisée pour personnaliser les traitements en fonction des réponses thérapeutiques des AOP.

Protocol

Tous les échantillons de tissus humains prélevés pour la recherche ont été obtenus conformément au protocole approuvé par le Comité d’examen institutionnel (CISR). Les protocoles décrits ci-dessous ont été exécutés dans un environnement stérile de culture de tissus humains. Le consentement écrit éclairé a été obtenu de sujets humains. Les patientes admissibles devaient avoir un diagnostic ou un diagnostic présumé de cancer de l’ovaire, être disposées et capables de signer un consentement éclai…

Representative Results

Pour générer des AOP, les échantillons ont été digérés mécaniquement et enzymatiquement en suspensions unicellulaires. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans des BME et complétées par des milieux spécialement conçus (Figure 3). Les organoïdes sont généralement établis sur une période de 10 jours, après quoi ils démontrent des organoïdes discrets en culture (Figure 4). <p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.w…

Discussion

Le cancer de l’ovaire est extrêmement mortel en raison de son stade avancé au moment du diagnostic, ainsi que du développement courant de la résistance à la chimiothérapie. De nombreux progrès dans la recherche sur le cancer de l’ovaire ont été réalisés en utilisant des lignées cellulaires cancéreuses et des modèles PDX; Cependant, il existe un besoin évident d’un modèle in vitro plus représentatif et abordable. Les AOP se sont avérées représenter avec précision l’hétérogénéité …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants des conseils de Ron Bose, MD, PhD, et de l’aide de Barbara Blachut, MD, dans l’établissement de ce protocole. Nous tenons également à remercier l’École de médecine du Département d’obstétrique et de gynécologie et la Division d’oncologie gynécologique de l’Université de Washington, le Dean’s Scholar Program de l’Université de Washington et le Reproductive Scientist Development Program pour leur soutien à ce projet.

Materials

1% HEPES Life Technologies 15630080
1% Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 30002CI
1.5 mL Eppendorf Tubes  Genesee Scientific 14125
10 cm Tissue Culture Dish  TPP 93100
10 mL Serological Pipet
100 µm Cell Filter MidSci 100ICS
15 mL centrifuge tubes Corning 430052
2 mL Cryovial Simport Scientific T301-2
2% Paraformaldehyde Fixative Sigma-Aldrich
37 °C water bath  NEST 602052
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement Millipore Sigma SCM104
6 well plates TPP 92006
70% Ethanol Sigma-Aldrich R31541GA
A83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher 12634028
Agar Lamda Biotech C121
B-27 Life Technologies 17504044
Centrifuge 
Cultrex Type 2 R&D Systems 3533-010-02 basement membrane extract
DNase I New England Bio Labs M0303S
DNase I Reaction Buffer New England Bio Labs M0303S
EGF PeproTech AF-100-15
FBS  Sigma-Aldrich F2442
FGF-10 PeproTech 100-26
FGF2 PeproTech 100-18B
gentleMACS C Tubes Miltenyi BioTech 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi BioTech 130-096-427 We use the manufacturers protocol.
GlutaMAX Life Technologies 35050061 dipeptide, L-alanyl-L-glutamine
Hematoxylin and Eosin Staining Kit Fisher Scientific NC1470670
Histoplast Paraffin Wax Fisher Scientific 22900700
Microcentrifuge 
Mr. Frosty Freezing Container Fisher Scientific 07202363S
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
p1000 Pipette with Tips 
p200 Pipette with Tips 
Pasteur Pipettes 9" Fisher Scientific 1367820D
PBS Fisher Scientific MT21031CM
Pipet Controller
Prostaglandin E2 R&D Systems 2296
Puromycin  ThermoFisher A1113802
Recombinant Murine Noggin PeproTech 250-38
Recovery Cell Culture Freezing Medium Invitrogen 12648010
Red Blood Cell Lysis Buffer BioLegend 420301
ROCK Inhibitor (Y-27632) R&D Systems 1254/1
SB202190 Sigma-Aldrich S7076
T75 Flask MidSci TP90076
Tissue Culture Hood 
Tissue Embedding Cassette
TrypLE Express Invitrogen 12604013 animal origin-free, recombinant enzyme
Type II Collagenase Life Technologies 17101015
Vortex

References

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Cite This Article
Graham, O., Rodriguez, J., van Biljon, L., Fashemi, B., Graham, E., Fuh, K., Khabele, D., Mullen, M. Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids. J. Vis. Exp. (191), e64878, doi:10.3791/64878 (2023).

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