Biology

सिमुलेशन पर्यवेक्षित सीखने के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64880

Abhinanda Ranjit Punnakkal¹, Gustav Godtliebsen², Ayush Somani¹, Sebastian Andres Acuna Maldonado³, Åsa Birna Birgisdottir^2,4, Dilip K. Prasad¹, Alexander Horsch¹, Krishna Agarwal³

¹Department of Computer Science, UiT The Arctic University of Norway, ²Department of Clinical Medicine, UiT The Arctic University of Norway, ³Department of Physics and Technology, UiT The Arctic University of Norway, ⁴Division of Cardiothoracic and Respiratory Medicine, University Hospital of North Norway

Summary

यह लेख बताता है कि निश्चित कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों में माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए सिमुलेशन-पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग का उपयोग कैसे करें।

Abstract

सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में माइटोकॉन्ड्रिया जैसे उपकोशिकीय जीवों का मात्रात्मक विश्लेषण इन छोटे और रूपात्मक रूप से विविध संरचनाओं के विभाजन में अंतर्निहित चुनौतियों के कारण एक मांग वाला कार्य है। इस लेख में, हम निश्चित कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान की मात्रा का ठहराव के लिए एक मशीन लर्निंग-एडेड विभाजन और विश्लेषण पाइपलाइन के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। डीप लर्निंग-आधारित विभाजन उपकरण को नकली छवियों पर प्रशिक्षित किया जाता है और पर्यवेक्षित गहरी शिक्षा के लिए जमीनी सच्चाई एनोटेशन की आवश्यकता को समाप्त करता है। हम फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया मार्करों की स्थिर अभिव्यक्ति के साथ निश्चित कार्डियोमायोब्लास्ट्स की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों पर इस उपकरण की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए विशिष्ट सेल संस्कृति स्थितियों को नियोजित करते हैं।

Introduction

इस पेपर में, हम फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया मार्करों को व्यक्त करने वाले निश्चित कार्डियोमायोब्लास्ट्स की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में उपकोशिकीय विभाजन¹ के लिए भौतिकी-आधारित मशीन लर्निंग टूल की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं।

माइटोकॉन्ड्रिया स्तनधारी कोशिकाओं में मुख्य ऊर्जा उत्पादक जीव हैं। विशेष रूप से, माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक गतिशील ऑर्गेनेल हैं और अक्सर नेटवर्क में पाए जाते हैं जो लगातार लंबाई और शाखाओं में बदल रहे हैं। माइटोकॉन्ड्रिया का आकार उनके कार्य को प्रभावित करता है, और कोशिकाएं पर्यावरण में बदलाव के अनुकूल होने के लिए अपने माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान को जल्दी से बदल सकती^हैं। इस घटना को समझने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया का रूपात्मक वर्गीकरण डॉट्स, रॉड या नेटवर्क के^{रूप में अत्यधिक} जानकारीपूर्ण है।

कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का विभाजन महत्वपूर्ण है। माइटोकॉन्ड्रिया की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों को विभाजित और विश्लेषण करने के वर्तमान तरीके मैनुअल विभाजन या पारंपरिक छवि प्रसंस्करण दृष्टिकोण पर निर्भर करते हैं। माइक्रोस्कोपी छवियों में उच्च शोर के स्तर के कारण ओत्सु⁴ जैसे थ्रेसहोल्डिंग-आधारित दृष्टिकोण कम सटीक हैं। आमतौर पर, माइटोकॉन्ड्रिया के रूपात्मक विश्लेषण के लिए छवियों में बड़ी संख्या में माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं, जिससे मैनुअल विभाजन थकाऊ हो जाता है। मोर्फोलिबजे⁵ जैसे गणितीय दृष्टिकोण और वेका⁶ जैसे अर्ध-पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग दृष्टिकोण अत्यधिक मांग वाले हैं और विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता होती है। माइटोकॉन्ड्रिया⁷ के लिए छवि विश्लेषण तकनीकों की समीक्षा से पता चला है कि कार्य के लिए गहरी सीखने-आधारित तकनीक उपयोगी हो सकती है। दरअसल, स्व-ड्राइविंग जैसे अनुप्रयोगों के लिए रोजमर्रा की जिंदगी की छवियों में छवि विभाजन को गहन शिक्षण-आधारित मॉडल के उपयोग के साथ क्रांतिकारी बनाया गया है।

डीप लर्निंग मशीन लर्निंग का एक उप-समूह है जो एल्गोरिदम प्रदान करता है जो बड़ी मात्रा में डेटा से सीखता है। पर्यवेक्षित गहन शिक्षण एल्गोरिदम छवियों के बड़े सेटों से संबंध सीखते हैं जो उनके जमीनी सत्य (जीटी) लेबल के साथ एनोटेट किए जाते हैं। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में माइटोकॉन्ड्रिया को विभाजित करने के लिए पर्यवेक्षित गहरी शिक्षा का उपयोग करने में चुनौतियां दो गुना हैं। सबसे पहले, पर्यवेक्षित गहरी शिक्षा के लिए प्रशिक्षण छवियों के एक बड़े डेटासेट की आवश्यकता होती है, और, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के मामले में, इस बड़े डेटासेट को प्रदान करना अधिक आसानी से उपलब्ध पारंपरिक कैमरा-आधारित छवियों का उपयोग करते समय एक व्यापक कार्य होगा। दूसरे, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों को प्रशिक्षण छवियों में रुचि की वस्तुओं के जीटी एनोटेशन की आवश्यकता होती है, जो एक थकाऊ कार्य है जिसके लिए विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंटली लेबल उपकोशिकीय संरचनाओं के साथ कोशिकाओं की एकल छवि के लिए यह कार्य आसानी से विशेषज्ञ के समय के घंटे या दिन ले सकता है। इसके अलावा, एनोटेटर के बीच भिन्नताएं एक समस्या पैदा करती हैं। मैनुअल एनोटेशन की आवश्यकता को दूर करने के लिए, और गहरी सीखने की तकनीकों के बेहतर प्रदर्शन का लाभ उठाने में सक्षम होने के लिए, यहां एक गहरी सीखने-आधारित विभाजन मॉडल का उपयोग किया गया था जिसे नकली छवियों पर प्रशिक्षित किया गया था। भौतिकी-आधारित सिमुलेटर एक माइक्रोस्कोप में छवि निर्माण की प्रक्रिया की नकल और नियंत्रण करने का एक तरीका प्रदान करते हैं, जिससे ज्ञात आकृतियों की छवियों के निर्माण की अनुमति मिलती है। भौतिकी-आधारित सिम्युलेटर का उपयोग करते हुए, इस उद्देश्य के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के सिम्युलेटेड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों का एक बड़ा डेटासेट बनाया गया था।

सिमुलेशन आकार पीढ़ी के लिए पैरामीट्रिक वक्रों का उपयोग करके ज्यामिति पीढ़ी के साथ शुरू होता है। उत्सर्जकों को यादृच्छिक रूप से आकार की सतह पर समान रूप से वितरित तरीके से रखा जाता है ताकि घनत्व प्रयोगात्मक मूल्यों से मेल खाता हो। माइक्रोस्कोप के एक 3 डी पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन (पीएसएफ) की गणना गिब्सन-लैनी मॉडल⁹ के कम्प्यूटेशनल रूप से कुशल सन्निकटन⁸ का उपयोग करके की जाती है। प्रयोगात्मक छवियों के साथ नकली छवियों का बारीकी से मिलान करने के लिए, फोटो यथार्थवाद प्राप्त करने के लिए अंधेरे प्रवाह और शॉट शोर दोनों का अनुकरण किया जाता है। भौतिक जीटी एक द्विआधारी मानचित्र के रूप में उत्पन्न होता है। डेटासेट उत्पन्न करने और सिमुलेशन मॉडल को प्रशिक्षित करने के लिए कोड^{उपलब्ध है 10}, और इस सिम्युलेटेड डेटासेट को बनाने के लिए चरण चित्रा 1 में उल्लिखित है।

हम निश्चित कार्डियोमायोब्लास्ट्स की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों का विश्लेषण करके पूरी तरह से एक सिम्युलेटेड डेटासेट पर प्रशिक्षित गहन शिक्षण-आधारित विभाजन की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं। इन कार्डियोमायोब्लास्ट्स ने माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली में एक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त किया, जिससे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में माइटोकॉन्ड्रिया के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिली। यहां एक उदाहरण के रूप में दिए गए प्रयोग का संचालन करने से पहले, कोशिकाओं को ग्लूकोज से वंचित किया गया था और संस्कृति में 7 दिनों के लिए गैलेक्टोज के लिए अनुकूलित किया गया था। गैलेक्टोज के साथ विकास मीडिया में ग्लूकोज को बदलने से संस्कृति में कोशिकाएं अधिक ऑक्सीडेटिव हो जाती हैं और इस प्रकार, ऊर्जा उत्पादन के लिए उनके माइटोकॉन्ड्रिया पर निर्भर^होती ^हैं। इसके अलावा, यह कोशिकाओं को माइटोकॉन्ड्रियल क्षति के प्रति अधिक संवेदनशील बनाता है। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान परिवर्तनों को कोशिका संस्कृति माध्यम¹³ में कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफेनिल हाइड्राज़ोन (सीसीसीपी) जैसे माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग एजेंट को जोड़कर प्रयोगात्मक रूप से प्रेरित किया जा सकता है। सीसीसीपी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एयूएम) के नुकसान की ओर जाता है और इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रिया में अधिक ट्यूबलर (रॉड जैसी) से अधिक गोलाकार (डॉट-जैसे) आकृति विज्ञान^में परिवर्तन होता है। इसके अलावा, सीसीसीपी उपचार 15 के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया सूज^जाते हैं। हम माइटोकॉन्ड्रिया परिवर्तनों के रूपात्मक वितरण को प्रदर्शित करते हैं जब गैलेक्टोज-अनुकूलित कार्डियोमायोब्लास्ट्स को माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर सीसीसीपी के साथ इलाज किया गया था। माइटोकॉन्ड्रिया के गहरे सीखने के विभाजन ने हमें उन्हें डॉट्स, रॉड या नेटवर्क के रूप में वर्गीकृत करने में सक्षम बनाया। फिर हमने विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल फेनोटाइप्स की शाखा लंबाई और बहुतायत का आकलन करने के लिए मात्रात्मक मैट्रिक्स प्राप्त किए। विश्लेषण के चरणों को चित्रा 2 में उल्लिखित किया गया है, और सेल संस्कृति, इमेजिंग, गहरी शिक्षा-आधारित विभाजन के लिए डेटासेट निर्माण, साथ ही माइटोकॉन्ड्रिया के मात्रात्मक विश्लेषण का विवरण नीचे दिया गया है।

Protocol

नोट: ज्ञात प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ माइटोकॉन्ड्रिया की मौजूदा माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ काम करते समय अनुभाग 1-4 को छोड़ा जा सकता है।

1. सेल संस्कृति

2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 10 एमएम गैलेक्टोज, 10% एफबीएस, 1% स्ट्रेप्टोमाइसिन / पेनिसिलिन, और 1 μg / mL प्यूरोमाइसिन के साथ पूरक ग्लूकोज के बिना डीएमईएम में एच 9 सी 2 कोशिकाओं को विकसित करें। प्रयोगों से पहले कोशिकाओं को संस्कृति में कम से कम 7 दिनों के लिए गैलेक्टोज के अनुकूल होने की अनुमति दें।
नोट: यहां उपयोग की जाने वाली एच 9 सी 2 कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया है और एक प्यूरोमाइसिन प्रतिरोध जीन भी हासिल किया है। इस एंटीबायोटिक के अलावा प्रतिरोध जीन और इस प्रकार, फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के साथ कोशिकाओं के विकास को सुनिश्चित करता है।
प्रयोग के लिए H9c2 कोशिकाओं को बीज दें जब सेल कंफ्लुएंसी लगभग 80% तक पहुंच जाती है (T75 कल्चर फ्लास्क, ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जाता है)। आगे बढ़ने से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए मध्यम और ट्रिप्सिन को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
नोट: दो या दो से अधिक अलग-अलग सेल संस्कृति स्थितियों के समानांतर प्रयोग करना संभव है। मायोब्लास्टिक कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए एच 9 सी 2 सेल कंफ्लुएंसी 80% से ऊपर नहीं होनी चाहिए। 100% कंफ्लुएंसी पर, कोशिकाएं मायोट्यूब बनाती हैं और अंतर करना शुरू कर देती हैं।
12-वेल प्लेट के कुएं में प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए # 1.5 ग्लास कवरस्लिप रखकर, बाँझ लामिनार प्रवाह हुड में संचालित कोशिकाओं को सीड करने के लिए तैयार करें। प्रत्येक स्थिति और प्रयोगात्मक विवरण को 12-वेल प्लेट पर लेबल करें।
सेल कल्चर फ्लास्क को इनक्यूबेटर से हुड में काम की सतह पर ले जाएं। एस्पिरेशन सिस्टम या इलेक्ट्रॉनिक पिपेट का उपयोग करके माध्यम को एस्पिरेटेड करें, और फिर पीबीएस (कमरे के तापमान) के 5 एमएल के साथ दो बार धोएं।
पूर्व-गर्म ट्रिप्सिन को काम की सतह पर ले जाएं, और अंतिम पीबीएस धोने के लिए तैयार करें; फिर, कोशिकाओं को अलग करने के लिए पूर्व-गर्म ट्रिप्सिन जोड़ें (टी 75 कल्चर फ्लास्क के लिए 1 एमएल)। कल्चर फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
इनक्यूबेशन के अंत की ओर पूर्व-गर्म माध्यम को कार्य सतह पर ले जाएं। सत्यापित करें कि कोशिकाओं को एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अलग कर दिया गया है।
1. यदि सभी कोशिकाएं अलग नहीं हुई हैं, तो शेष कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लास्क के किनारे पर कई सावधानीपूर्वक लेकिन दृढ़ नल लागू करें।
संस्कृति फ्लास्क को काम की सतह पर वापस करें। ट्रिप्सिन कार्रवाई को रोकने के लिए इलेक्ट्रॉनिक पिपेट का उपयोग करके संस्कृति फ्लास्क में 4 एमएल सेल कल्चर माध्यम जोड़ें। फ्लास्क में कल्चर माध्यम जोड़ते समय, कोशिकाओं को सेल निलंबन में अलग करने और इकट्ठा करने के लिए सतह पर माध्यम को बार-बार फैलाने के लिए पिपेट का उपयोग करें।
फ्लास्क से सेल सस्पेंशन (5 एमएल) को 15 एमएल ट्यूब में बदलें।
5 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। हुड में ट्यूब खोलें, आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और सेल कल्चर मीडिया के 5 एमएल में सेल पेलेट को धीरे से फिर से निलंबित करें।
एक स्वचालित सेल काउंटर में सेल निलंबन की एक छोटी मात्रा का विश्लेषण करके कोशिकाओं की संख्या का आकलन करें। संस्कृति मीडिया के प्रति मिलीलीटर जीवित कोशिकाओं की संख्या पर ध्यान दें।
सेल निलंबन की वांछित मात्रा (जैसे, 150 μL प्रति कुआं) को पूर्व-लेबल 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ले जाएं, जिसकी गणना लगभग 2 x 10⁴ कोशिकाओं / सेमी² के सीडिंग घनत्व के लिए की जाती है। कुओं की संख्या के आधार पर पूर्व-गणना की गई मात्रा पर 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पूर्व-गर्म सेल कल्चर माध्यम जोड़ें। 12-वेल प्लेटों के लिए, प्रत्येक कुएं के लिए 1 एमएल की कुल मात्रा का उपयोग करें।
सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं को उचित मात्रा देने से पहले सेंट्रीफ्यूज ट्यूब की सामग्री को कई बार ऊपर और नीचे करके पतला सेल निलंबन ठीक से मिश्रित किया जाता है। एक बार जब सेल निलंबन कुएं में वितरित हो जाता है, तो प्लेट को प्रत्येक दिशा में सावधानीपूर्वक नियंत्रित तरीके से हिलाएं ताकि कोशिकाओं को पूरे कुओं में बेहतर ढंग से वितरित किया जा सके। अगले दिन तक 12-वेल प्लेट को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
विकास का मूल्यांकन करने के लिए एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की जांच करें। यदि कोशिकाओं ने लगभग 80% स्थिरता के लिए पर्याप्त वृद्धि हासिल कर ली है, तो अगले चरणों पर आगे बढ़ें; अन्यथा, मूल्यांकन को दैनिक रूप से दोहराएं जब तक कि पर्याप्त विकास नहीं हो जाता।

2. प्रायोगिक प्रक्रिया

स्टॉक समाधान सांद्रता के अनुसार प्रयोग के लिए आवश्यक सामग्री की मात्रा की गणना करें। जमे हुए पदार्थों (30 एमएम सीसीसीपी स्टॉक समाधान) को 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं, और सेल कल्चर माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्मी के लिए सेट करें।
पिघलने के बाद, सेल कल्चर माध्यम में स्टॉक समाधान (1: 3,000) को पतला करके 10 μM CCCP का एक कामकाजी समाधान बनाएं।
नोट: 1 μL से कम मात्रा में पिपेट वॉल्यूम न करें।
सभी आवश्यक सामग्रियों को तैयार करने और पूर्व-गर्म करने के बाद प्रयोगात्मक उपचार शुरू करें। 12-वेल प्लेट के कुओं से सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें, और फिर परीक्षण स्थिति कुओं में 10 μM CCCP समाधान के साथ ताजा पूर्व-गर्म माध्यम को जल्दी से लागू करें।
2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर में 12-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि के दौरान, निर्धारण समाधान तैयार करें।
निर्धारण समाधान की तैयारी के लिए, 25% ग्लूटारल्डिहाइड (जीए) स्टॉक समाधान को 0.2% (1: 125) तक पतला करने के लिए पूर्व-निर्मित 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करें। घोल को 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्मी के लिए सेट करें। 12-वेल प्लेट के लिए, 500 μL प्रति कुएं पर्याप्त है।
चेतावनी: पीएफए और जीए जहरीले रसायन हैं। सुरक्षात्मक गियर के साथ एक रासायनिक हुड में काम करें। विवरण के लिए उनके संबंधित एसडीएस देखें।
जब इनक्यूबेशन अवधि पूरी हो जाती है, तो इनक्यूबेटर से 12-वेल प्लेट को हटा दें, और इसे काम की सतह पर रखें।
नोट: काम को अब बाँझ वातावरण की आवश्यकता नहीं है।
कुओं से सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें, और पूर्व-गर्म निर्धारण समाधान लागू करें। 12-वेल प्लेट को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस करें।
इनक्यूबेशन को पूरा करने पर निर्धारण समाधान को एस्पिरेट करें, और कमरे के तापमान पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार धोएं। प्रोटोकॉल के इस चरण में प्रयोग को रोकना और बाद में जारी रखना संभव है।
1. यदि प्रयोग को रोक दिया जाता है, तो प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल पीबीएस जोड़ें, प्लास्टिक फिल्म (पैराफिल्म) के साथ 12-वेल प्लेट को सील करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. कवरलिप्स पर कोशिकाओं का धुंधला होना और बढ़ना

DAPI (परमाणु दाग) स्टॉक को पिघलाएं, और खोलने से पहले एक मिनी सेंट्रीफ्यूज में घूमें। पीबीएस (1: 1,000) में DAPI स्टॉक को पतला करके DAPI धुंधला समाधान तैयार करें।
12-वेल प्लेट से पीबीएस को एस्पिरेट करें, और प्रत्येक कुएं पर 1 एमएल डीएपीआई धुंधला घोल लागू करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
DAPI धुंधला घोल को एस्पायरेट करें। प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
70% इथेनॉल में धोकर फ्रॉस्टेड ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड (ग्लास स्लाइड) तैयार करें, इसके बाद पीबीएस में तीन वॉश करें। लिंट-फ्री पेपर तौलिए का उपयोग करके स्लाइड्स को सावधानीपूर्वक सुखाएं, और धूल या ग्रीस के संकेतों की जांच करने के लिए उन्हें प्रकाश की ओर निर्देशित करें।
नोट: इस चरण के लिए दस्ताने आवश्यक हैं।
प्रयोगात्मक विवरण के साथ ग्लास स्लाइड्स को लेबल करें। बढ़ते माध्यम को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और एक मिनी सेंट्रीफ्यूज में नीचे घूमें।
कार्यक्षेत्र की व्यवस्था करके कवरलिप्स को बढ़ाने के लिए तैयार रहें। कवरलिप्स, लेबल ग्लास स्लाइड, माउंटिंग मीडियम, एक पिपेट, 10 μL पिपेट टिप्स, लिंट-फ्री पेपर तौलिए और चिमटी के साथ एक 12-वेल प्लेट तैयार रखें।
एक कवरस्लिप को माउंट करने के लिए तैयार ग्लास स्लाइड पर 10 μL माउंटिंग मीडियम (प्रोलॉन्ग ग्लास) लागू करें।
चिमटी का उपयोग करके 12-वेल प्लेट से कवरस्लिप उठाएं, और कवरस्लिप के किनारे और पीछे को संक्षेप में स्पर्श करके तैयार लिंट-फ्री पेपर टॉवल से नमी को दबाएं। धीरे से बढ़ते माध्यम की बूंद पर कवरस्लिप को नीचे गिराएं।
प्रत्येक कवरस्लिप के लिए उपरोक्त दो चरणों को दोहराएं। प्रति ग्लास स्लाइड में एक से चार कवरलिप के बीच अनुमति देने के लिए बढ़ती मध्यम बूंदों को रखें।
सुनिश्चित करें कि ग्लास स्लाइड एक सपाट सतह पर हैं ताकि माउंटेड कवरलिप्स को आगे बढ़ने से बचाया जा सके। बढ़ते माध्यम को सेट करने की अनुमति देने के लिए रात भर कमरे के तापमान पर एक अंधेरे स्थान पर ग्लास स्लाइड रखें। नमूने अब इमेजिंग के लिए तैयार हैं। प्रयोग को प्रोटोकॉल के इस चरण में रोका जा सकता है और बाद में जारी रखा जा सकता है।
यदि प्रयोग को इस स्तर पर रोक दिया जाता है, तो नमूनों को कमरे के तापमान पर रात भर सेट करने की अनुमति देने के बाद, उन्हें प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में कवर करें, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग

परिवहन के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में नमूने कवर करें (यदि पहले से ही नहीं किया गया है)।
माइक्रोस्कोपी सुविधा में पहुंचने पर, ग्लास स्लाइड पर कवरलिप्स से पीबीएस अवशेषों को साफ करने के लिए माइक्रोस्कोप फिल्टर पेपर के साथ डबल-डिस्टिल्ड एच₂ओ का उपयोग करें। कांच की स्लाइड्स को उज्ज्वल प्रकाश की ओर पकड़कर जांचें कि कवरलिप्स पर कोई धब्बे नहीं हैं।
माइक्रोस्कोप के लिए स्टार्टअप प्रक्रिया के माध्यम से जाएं। उपयुक्त उद्देश्य (प्लान-एपोक्रोमैट 63x/1.40 Oil M27) का चयन करें, और विसर्जन माध्यम जोड़ें।
नमूना धारक में नमूना रखें। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के भीतर, ईजीएफपी फ्लोरेसेंस रोशनी को सक्रिय करने के लिए "लोकेट" टैब का उपयोग करें, और ओकुलर का उपयोग करके, नमूने को फोकस में रखने के लिए जेड-स्तर को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। फोकस खोजने पर प्रतिदीप्ति रोशनी बंद करें।
माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के भीतर "अधिग्रहण" टैब पर स्विच करें। इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिदीप्ति चैनलों का चयन करने के लिए "स्मार्ट सेटअप" का उपयोग करें। इस प्रयोग के लिए, ईजीएफपी और डीएपीआई चैनल प्रीसेट का चयन किया गया था।
अनुकूलित सिग्नल शक्ति के लिए एक गाइड के रूप में तीव्रता हिस्टोग्राम का उपयोग करके प्रारंभिक सेटिंग्स से प्रत्येक चैनल तीव्रता को समायोजित करें। इमेजिंग अब शुरू हो सकती है।
इमेजिंग के लिए, इमेजिंग स्थितियों को एक सरणी में रखने के लिए सॉफ्टवेयर के विकल्प का उपयोग करें, और छवि बनाने के लिए 12 कुल पदों के साथ कवरस्लिप के बीच में सरणी को केंद्रित करें। सत्यापित करें कि सरणी में प्रत्येक स्थिति में कक्ष हैं। यदि कोई कोशिकाएं नहीं हैं, तो कोशिकाओं के साथ एक क्षेत्र में स्थिति को समायोजित करें।
माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के ऑटोफोकस का उपयोग करके सरणी में प्रत्येक स्थिति के फोकस को समायोजित करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए मैन्युअल ठीक समायोजन के साथ इसका पालन करें कि अधिक से अधिक माइटोकॉन्ड्रिया फोकस में हैं।
नोट: ईजीएफपी चैनल इन मैनुअल समायोजन के लिए उपयोग किया जाता है।
प्रत्येक कवरस्लिप के लिए इस विधि का उपयोग करके चित्र प्राप्त करें। छवि फ़ाइलों को सहेजें, और रूपात्मक विश्लेषण के लिए चरणों पर आगे बढ़ें।

5. नकली प्रशिक्षण डेटा उत्पन्न करना

कोड¹⁰ डाउनलोड करें, और सामग्री को अनज़िप करें। आवश्यक वातावरण सेट करने के लिए README.md में निर्देशों का पालन करें।
"एसआरसी" नामक फ़ोल्डर पर नेविगेट करें, जो इस प्रोजेक्ट के लिए होम फ़ोल्डर है। अंदर क्रमांकित फ़ोल्डरों में कोड होते हैं जो उपकरण का उपयोग करने के विभिन्न चरणों के लिए विशिष्ट होते हैं।
नोट: कोड के किसी भी सबफ़ोल्डर पर नेविगेट करने के लिए कमांड "cd <>" का उपयोग करें। किसी भी पायथन फ़ाइल को चलाने के लिए, कमांड का उपयोग करें, "पायथन <<फाइल नाम>>.py"। "ट्यूटोरियल.pptx" नामक प्रस्तुति में विभाजन मॉडल का उपयोग करने के लिए निर्देशों का एक पूरा सेट शामिल है।
एक प्रतिलिपि बनाएँ या फ़ोल्डर "2" का उपयोग करें। माइटोकॉन्ड्रिया सिमुलेशन ऐरी", और इसका नाम बदलें (ऐरी का उपयोग यहां किया जाता है क्योंकि यह एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के निकटतम पीएसएफ फ़ंक्शन है, जिसे वर्तमान माइक्रोस्कोप के रूप में उपयोग किया गया था)। "सिम्युलेटर" नामक फ़ोल्डर में जाएं।
नोट: इस फ़ोल्डर में प्रशिक्षण डेटा के सिमुलेशन से संबंधित सभी फ़ाइलें हैं। सिमुलेशन के लिए मापदंडों के तीन सेट सेट सेट किए जाने हैं।
सबसे पहले, बैच कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल "सिम्युलेटर / बैच / बीएक्सएक्स.csv" में सिम्युलेटर के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या, व्यास की सीमा और संरचनाओं की लंबाई, संरचना प्रदर्शित करने वाले जेड-अक्ष की सीमा और फ्लोरोफोरेस के घनत्व सहित नमूने के बारे में पैरामीटर निर्धारित करें।
इसके बाद, ऑप्टिकल सिस्टम से संबंधित पैरामीटर सेट करें।
1. इस सेट में माइक्रोस्कोप का प्रकार (जो निर्धारित करता है कि कौन सा पीएसएफ मॉडल चुना गया है), संख्यात्मक एपर्चर (एनए), आवर्धन (एम), पिक्सेल आकार (μm में), फ्लोरोफोरेस की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, और पृष्ठभूमि शोर पैरामीटर, आदि शामिल हैं।
2. फ़ाइल "सिम्युलेटर / microscPSFmod.py" में एनए के ऑप्टिकल पैरामीटर, आवर्धन और डेटासेट की न्यूनतम तरंग दैर्ध्य सेट करें।
3. पिक्सेल आकार के लिए वांछित मान सेट करें, और फ़ाइल "सिम्युलेटर / generate_batch_parallel.py" में "process_matrix_all_z" फ़ंक्शन के लिए पैरामीटर के रूप में डेटासेट के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को सेट करें।
4. फ़ाइल "सिम्युलेटर / generate_batch_parallel.py" में फ़ंक्शन "save_physics_gt" के अंतिम तीन पैरामीटर सेट करें। पैरामीटर पिक्सेल आकार (एनएम में), आउटपुट छवि का आकार और max_xy हैं।
आउटपुट डेटासेट के बारे में मापदंडों का तीसरा सेट सेट करें, जैसे कि आउटपुट छवियों का आकार, प्रत्येक छवि में टाइल्स की संख्या, और फ़ाइल "सिम्युलेटर / generate_batch_parallel.py" में कुल छवियों की संख्या।
सिमुलेशन शुरू करने के लिए फ़ाइल "सिम्युलेटर / generate_batch_parallel.py" चलाएँ।
अंतिम आकार की छवि प्राप्त करने के लिए, "5" नामक फ़ोल्डर की एक प्रतिलिपि बनाएँ। होम फ़ोल्डर में डेटा तैयारी और प्रशिक्षण / डेटा तैयारी" और इसमें नेविगेट करें।
नोट: सिंथेटिक डेटासेट की प्रत्येक छवि 128 पिक्सेल x 128 पिक्सेल की चार नकली छवियों का एक मोंटाज बनाकर बनाई जाती है, जो 256 पिक्सेल x 256 पिक्सेल का अंतिम छवि आकार देती है। यह पहले माइक्रोस्कोप छवियों ("आउटपुट" फ़ोल्डर में) और ग्राउंड ट्रुथ विभाजन ("आउटपुट / physics_gt" फ़ोल्डर में) दोनों के लिए कई अलग-अलग टाइल्स (लगभग 12,000) उत्पन्न करता है।
1. बैच संख्या के पैरामीटर, प्रति बैच छवियों की संख्या, और "data_generator.py" में शोर की सीमा सेट करें।
2. मोंटेज छवियां बनाने के लिए फ़ाइल "data_generator.py" चलाएँ।
3. "छवि" और "सेगमेंट" नामक फ़ोल्डरों को "5" में कॉपी करें। फ़ोल्डर "5" से डेटा तैयारी और प्रशिक्षण / डेटाट्रेन / ट्रेन " फ़ोल्डर। डेटा तैयारी और प्रशिक्षण / डेटा तैयारी / डेटा"।

6. गहन शिक्षण-आधारित विभाजन

सिम्युलेटेड छवियों पर विभाजन मॉडल को निम्नानुसार प्रशिक्षित करें:
1. एक नए माइक्रोस्कोप के लिए विभाजन मॉडल को प्रशिक्षित करने के लिए, "5" पर नेविगेट करें। डेटा तैयारी और प्रशिक्षण / ट्रेन " फ़ोल्डर, और बैच आकार के मापदंडों, विभाजन के लिए बैकबोन मॉडल, युगों की संख्या, और फ़ाइल "train_UNet.py" में प्रशिक्षण के लिए सीखने की दर निर्धारित करें।
2. प्रशिक्षण शुरू करने के लिए "train_UNet.py" चलाएं। प्रशिक्षण प्रक्रिया सिम्युलेटेड सत्यापन सेट पर विभाजन के प्रदर्शन के लिए मीट्रिक प्रदर्शित करती है।
  नोट: प्रशिक्षण पूरा होने के बाद, मॉडल को "5" में "best_model.h5" के रूप में सहेजा जाता है। डेटा तैयारी और प्रशिक्षण / ट्रेन " फ़ोल्डर।
वास्तविक माइक्रोस्कोप छवियों पर मॉडल का परीक्षण करें जो एक आकार में विभाजित हैं जो निम्नलिखित चरणों के माध्यम से प्रशिक्षित मॉडल के लिए वांछनीय है।
1. "6" पर नेविगेट करें। परीक्षण डेटा तैयार करें", और "की प्रतिलिपि बनाएँ। png" फ़ोल्डर "png" में डेटा की फ़ाइलों को स्वरूपित करें।
2. छवियों को एक आकार में विभाजित करने के लिए फ़ाइल "split_1024_256.py" चलाएं जो प्रशिक्षित मॉडल के लिए वांछनीय है। यह "डेटा" फ़ोल्डर में छवियों के 256 पिक्सेल x 256 पिक्सेल आकार के फसलों का निर्माण करता है।
3. बनाए गए "डेटा" फ़ोल्डर को "7" में कॉपी करें। विभाजन का परीक्षण करें "फ़ोल्डर.
4. फ़ोल्डर "7" पर नेविगेट करें। परीक्षण विभाजन", और उपयोग किए जाने वाले सहेजे गए मॉडल का नाम सेट करें।
5. फसलों को विभाजित करने के लिए, फ़ाइल "segment.py" चलाएँ। खंडित छवियों को "आउटपुट" फ़ोल्डर में सहेजा जाता है।

7. रूपात्मक विश्लेषण: दो डेटा समूहों, "ग्लूकोज" और "सीसीसीपी" के माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण

विश्लेषण किए जाने वाले डेटा को व्यवस्थित करें (प्रत्येक छवि के लिए एक फ़ोल्डर, जिसमें प्रत्येक फ़ोल्डर में एक छवि के खंडित आउटपुट फसलें होती हैं)।
डाउनलोड करें और "make_montage.py" नामक पूरक फ़ाइल को "7" नामक फ़ोल्डर में रखें। परीक्षण विभाजन".
सेगमेंट किए गए आउटपुट को छवि के मूल आकार में वापस सिलाई करने के लिए फ़ाइल "make_montage.py" चलाएं।
"9" नाम का एक नया फ़ोल्डर बनाएँ । "एसआरसी" फ़ोल्डर के अंदर रूपात्मक विश्लेषण"।
"पिप इंस्टॉल सीबोर्न[आँकड़े] स्कान" कमांड का उपयोग करके पर्यावरण में स्कान¹⁶ और सीबोर्न पायथन पैकेज स्थापित करें।
नोट: प्रत्येक व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रियन की टोपोलॉजी के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए स्कैन नामक लाइब्रेरी का उपयोग करके विभाजन मास्क को कंकालीकृत किया जाता है।
पूरक फ़ाइल "analyze_mitochondria.py" को फ़ोल्डर "9" में रखें । रूपात्मक विश्लेषण".
प्रयोग के विभिन्न समूहों की छवियों को फ़ोल्डर "7" के अंदर विभिन्न फ़ोल्डरों में व्यवस्थित करें। परीक्षण विभाजन".
फ़ाइल "analyze_mitochondria.py" में "पिक्सेल आकार" और "इनपुट पथ " के पैरामीटर सेट करें।
विश्लेषण के प्लॉट को स्केल करने और बनाने के लिए कोड चलाने के लिए फ़ाइल "analyze_mitochondria.py" चलाएं।

Representative Results

फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया मार्करों को व्यक्त करने वाले निश्चित कार्डियोमायोब्लास्ट्स की कॉन्फोकल छवियों में माइटोकॉन्ड्रिया के गहरे सीखने के विभाजन के परिणाम इस पद्धति की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं। यह विधि अन्य सेल प्रकारों और माइक्रोस्कोपी प्रणालियों के साथ संगत है, जिसमें केवल पुन: प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है।

फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के साथ गैलेक्टोज-अनुकूलित एच 9 सी 2 कार्डियोमायोब्लास्ट्स को 2 घंटे के लिए सीसीसीपी के साथ या बिना इलाज किया गया था। कोशिकाओं को तब तय किया गया था, एक परमाणु डाई के साथ दाग दिया गया था, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए ग्लास स्लाइड पर रखा गया था। नियंत्रण और सीसीसीपी-उपचारित कोशिकाओं दोनों की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। हमने प्रति स्थिति लगभग 60 कोशिकाओं के साथ 12 कॉन्फोकल छवियों पर अपना विश्लेषण किया। प्रत्येक छवि में माइटोकॉन्ड्रिया की आकृति विज्ञान की स्थिति तब निर्धारित और परिमाणित की गई थी। प्रशिक्षित मॉडल से प्राप्त विभाजन मास्क को इस प्रयोग के लिए प्रत्येक व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रियन की टोपोलॉजी के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए कंकालीकृत किया गया था। व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया की शाखा लंबाई का उपयोग वर्गीकरण के लिए पैरामीटर के रूप में किया गया था। व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया को निम्नलिखित नियम द्वारा रूपात्मक वर्गों में वर्गीकृत किया गया था। विशेष रूप से, 1,500 एनएम से कम लंबाई वाले किसी भी माइटोकॉन्ड्रियल कंकाल को एक बिंदु माना जाता था, और लंबे माइटोकॉन्ड्रिया को आगे नेटवर्क या रॉड में वर्गीकृत किया गया था। यदि कम से कम एक जंक्शन था जहां दो या दो से अधिक शाखाएं प्रतिच्छेद करती थीं, तो इसे नेटवर्क के रूप में परिभाषित किया गया था; अन्यथा, माइटोकॉन्ड्रियन को रॉड के रूप में वर्गीकृत किया गया था। आकृति विज्ञान वर्गों के साथ लेबल किए गए माइटोकॉन्ड्रियल कंकालों के साथ एक उदाहरण छवि चित्रा 3 में दिखाई गई है।

चित्रा 4 ए में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान वर्गीकरण से पता चलता है कि सीसीसीपी को 2 घंटे के लिए लागू करने पर महत्वपूर्ण परिवर्तनों का पता लगाना संभव है; यह सीसीसीपी-उपचारित कोशिकाओं के लिए डॉट्स में वृद्धि से सबसे स्पष्ट रूप से प्रदर्शित होता है।

चित्रा 4 बी में औसत शाखा की लंबाई आकृति विज्ञान में पता लगाने योग्य और महत्वपूर्ण परिवर्तनों को चित्रित करने के लिए एक और एवेन्यू है। रॉड और नेटवर्क दोनों, जैसा कि अपेक्षित था, नियंत्रण के सापेक्ष काफी कम हो गए थे जब कोशिकाओं को सीसीसीपी के साथ इलाज किया गया था। सीसीसीपी के संपर्क में आने पर माइटोकॉन्ड्रिया की सूजन को देखते हुए डॉट्स की औसत शाखा लंबाई में महत्वपूर्ण वृद्धि की भी उम्मीद थी।

चित्रा 1: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों के सिमुलेशन के लिए पाइपलाइन। पाइपलाइन में (i) 3 डी ज्यामिति पीढ़ी, (ii) उत्सर्जक और फोटोकाइनेटिक्स अनुकरण, (iii) 3 डी पीएसएफ कन्वोल्यूशन, (iv) शोर जोड़, और (वी) बिनाराइजेशन शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2: माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के मशीन लर्निंग-आधारित विश्लेषण के चरण। (1) खंडित की जाने वाली छवियों को पहले विभाजन मॉडल के लिए स्वीकार्य आकारों में क्रॉप किया जाता है। (2) गहरी शिक्षा-आधारित विभाजन छवि फसलों पर लागू होता है। (3) खंडित उत्पादन फसलों को उनके मूल आकार में वापस सिला जाता है। (4) मोंटेगेड विभाजन कंकालीकृत होते हैं। (6) कंकालीकरण से टोपोलॉजी के आधार पर रूपात्मक विश्लेषण आयोजित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: माइटोकॉन्ड्रियल कंकाल माइक्रोस्कोपी छवियों के विभाजन आउटपुट पर लगाया गया है। (बी) सीधी रेखा कंकाल (एक शाखा के प्रारंभ और अंत बिंदुओं के बीच यूक्लिडियन दूरी) विभाजन आउटपुट के शीर्ष पर रखा गया है। कंकाल की रंग कोडिंग माइटोकॉन्ड्रिया के वर्ग को दर्शाती है। नेटवर्क लाल हैं, छड़ हरे हैं, और डॉट्स रंग में बैंगनी हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण। (ए) कुल माइटोकॉन्ड्रियल लंबाई के आधार पर विभिन्न रूपात्मक श्रेणियों के सापेक्ष प्रतिशत का अवलोकन। (बी) प्रयोगात्मक स्थितियों और रूपात्मक श्रेणियों के बीच औसत माइटोकॉन्ड्रियल शाखा लंबाई की तुलना। एक्स-अक्ष रूपात्मक वर्गीकरण प्रदर्शित करता है, और वाई-अक्ष नैनोमीटर (एनएम) में माइटोकॉन्ड्रिया माध्य शाखा लंबाई प्रदर्शित करता है। पी-मानों के रूप में सांख्यिकीय महत्व को * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, और **** पी < 0.0001 के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5: विभाजन की विफलता का मामला। माइटोकॉन्ड्रिया का एक उच्च घनत्व विभाजन मॉडल के लिए एक चुनौतीपूर्ण परिदृश्य है। रंगीन कंकाल छवि में पाए गए सबसे लंबे एकल माइटोकॉन्ड्रिया को दर्शाता है। लंबाई माप के माध्यम से जाकर, इन परिदृश्यों का पता लगाया जा सकता है और रूपात्मक ऑपरेटर इरोड (पता लगाए गए कंकाल को पतला) का उपयोग करके विभाजन परिणामों को बेहतर बनाने के लिए काम किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम "ज्यामिति पीढ़ी" और "सिम्युलेटर मापदंडों" पर पैराग्राफ में प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों से संबंधित सावधानियों पर चर्चा करते हैं। "ट्रांसफर लर्निंग" शीर्षक वाले पैराग्राफ में कई माइक्रोस्कोप के अनुकूल होने पर उच्च थ्रूपुट के लिए संशोधनों पर चर्चा की गई है। "कण विश्लेषण" और "अन्य उपकोशिकीय संरचनाओं को उत्पन्न करना" पर पैराग्राफ इस पद्धति के भविष्य के अनुप्रयोगों को संदर्भित करते हैं। "जैविक सत्य से अंतर" पर पैराग्राफ विभिन्न कारणों पर चर्चा करता है कि सिमुलेशन वास्तविक डेटा से अलग क्यों हो सकते हैं और क्या ये कारण हमारे आवेदन को प्रभावित करते हैं। अंत में, हम "घनी संरचनाओं" पैराग्राफ में हमारी विधि के लिए एक चुनौतीपूर्ण परिदृश्य पर चर्चा करते हैं।

ज्यामिति उत्पादन
माइटोकॉन्ड्रिया की 3 डी ज्यामिति उत्पन्न करने के लिए, कंकाल के रूप में बी-स्लाइन वक्रों से बनाई गई एक सरल 2 डी संरचना सिंथेटिक डेटासेट के निर्माण के लिए अच्छी तरह से काम करती है। ये सिंथेटिक आकृतियाँ 2 डी सेल संस्कृतियों में देखे गए माइटोकॉन्ड्रिया के आकार का बारीकी से अनुकरण करती हैं। हालांकि, हृदय ऊतक जैसे 3 डी ऊतक के मामले में, माइटोकॉन्ड्रिया का आकार और व्यवस्था काफी अलग है। ऐसे मामलों में, सिम्युलेटेड छवियों में दिशात्मकता के अतिरिक्त विभाजन मॉडल के प्रदर्शन में सुधार हो सकता है।

सिम्युलेटर पैरामीटर
सिम्युलेटर के मापदंडों को सेट करते समय सावधानी बरतनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे अनुमान चलाने के लिए डेटा से मेल खाते हैं, क्योंकि ऐसा करने में विफलता से विभाजन पर कम प्रदर्शन हो सकता है। ऐसा ही एक पैरामीटर सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) रेंज है। परीक्षण किए जाने वाले डेटा के एसएनआर की सीमा सिम्युलेटेड डेटासेट के मूल्यों से मेल खानी चाहिए। इसके अतिरिक्त, उपयोग किए गए पीएसएफ को लक्ष्य परीक्षण डेटा से मेल खाना चाहिए। उदाहरण के लिए, एक कॉन्फोकल पीएसएफ से मॉडल-प्रशिक्षित छवियों का उपयोग एपि-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से छवियों का परीक्षण करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए। ध्यान देने के लिए एक और पैरामीटर परीक्षण डेटा में अतिरिक्त आवर्धन का उपयोग है। यदि परीक्षण डेटा में अतिरिक्त आवर्धन का उपयोग किया गया है, तो सिम्युलेटर को भी उचित रूप से सेट किया जाना चाहिए।

स्थानांतरण शिक्षा
ट्रांसफर लर्निंग एक कार्य पर प्रशिक्षित एक सीखे हुए मॉडल का दूसरे कार्य में उपयोग के लिए लाभ उठाने की घटना है। यह घटना विभिन्न प्रकार के माइक्रोस्कोप डेटा के संबंध में हमारी समस्या पर भी लागू होती है। विभाजन मॉडल (स्रोत कोड के साथ प्रदान किया गया) के वजन जो एक प्रकार के माइक्रोस्कोपी डेटा पर प्रशिक्षित होते हैं, का उपयोग किसी अन्य प्रकार के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप डेटा पर उपयोग किए जाने वाले विभाजन मॉडल को शुरू करने के लिए किया जा सकता है। यह हमें प्रशिक्षण डेटासेट (10,000 की तुलना में 3,000 छवियों) के काफी छोटे उप-समूह पर प्रशिक्षित करने की अनुमति देता है, जिससे सिमुलेशन की कम्प्यूटेशनल लागत कम हो जाती है।

कण विश्लेषण
खंडित मुखौटे पर कण विश्लेषण भी किया जा सकता है। यह व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के क्षेत्र और वक्रता आदि पर जानकारी प्रदान कर सकता है। यह जानकारी माइटोकॉन्ड्रिया की मात्रात्मक तुलना के लिए मैट्रिक्स के रूप में भी काम कर सकती है (इस प्रयोग के लिए उपयोग नहीं किया जाता है)। उदाहरण के लिए, वर्तमान में, हम माइटोकॉन्ड्रिया की लंबाई के आधार पर एक सीमा का उपयोग करके डॉट आकृति विज्ञान को परिभाषित करते हैं। कुछ मामलों में, छोटे रॉड जैसे माइटोकॉन्ड्रिया को पंक्टा या डॉट-जैसे माइटोकॉन्ड्रिया से बेहतर ढंग से अलग करने के लिए अंडाकारता को शामिल करना उपयोगी हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि कुछ जैविक स्थितियां माइटोकॉन्ड्रिया को घुंघराले करने का कारण बनती हैं, तो माइटोकॉन्ड्रियल आबादी का विश्लेषण करने के लिए वक्रता परिमाणीकरण रुचि का हो सकता है।

अन्य उप-सेलुलर संरचनाओं का निर्माण
माइटोकॉन्ड्रिया और पुटिकाओं के लिए उपकोशिकीय संरचनाओं के भौतिकी-आधारित^{विभाजन का प्रदर्शन} किया गया है। यद्यपि पुटिकाएं अलग-अलग आकार प्रदर्शित करती हैं, उनके आकार छोटे होते हैं, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखे जाने पर वे सरल गोले के रूप में दिखाई देते हैं। इसलिए, पुटिकाओं की ज्यामिति को एक उपयुक्त व्यास सीमा की गोलाकार संरचनाओं का उपयोग करके अनुकरण किया जाता है। इसका तात्पर्य है कि फ़ंक्शन में परिवर्तन संरचनाओं और संबंधित मापदंडों (प्रोटोकॉल अनुभाग में चरण 5.4) की ज्यामिति (माइटोकॉन्ड्रिया के मामले में सिलेंडर और पुटिकाओं के मामले में गोले) उत्पन्न करता है। ज्यामितीय रूप से, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और सूक्ष्मनलिकाएं भी ट्यूबलर संरचनाओं के रूप में अनुकरण की गई^हैं। 150 एनएम व्यास के साथ एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और 25 एनएम के औसत बाहरी व्यास और 15 एनएम व्यास की आंतरिक खोखले ट्यूब के साथ सूक्ष्मनलिकाएं मॉडलिंग इन संरचनाओं के आकार का अनुमान प्रदान करती है। एक अन्य पैरामीटर जो इन उप-सेलुलर संरचनाओं में से प्रत्येक के लिए भिन्न होगा, वह है फ्लोरोफोरे घनत्व। इसकी गणना बायोमोलेक्यूल के वितरण के आधार पर की जाती है जिसमें फ्लोरोफोरे बंधते हैं और बंधन की संभावना होती है।

जैविक जमीनी सच्चाई से अंतर
डीप लर्निंग मॉडल के सिमुलेशन-पर्यवेक्षित प्रशिक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले सिम्युलेटेड डेटा कई मायनों में वास्तविक डेटा से भिन्न होते हैं। (i) नकली आंकड़ों में गैर-विशिष्ट लेबलिंग की अनुपस्थिति वास्तविक डेटा से भिन्न होती है, क्योंकि वास्तविक डेटा में अक्सर फ्री-फ्लोटिंग फ्लोरोफोरे होते हैं। यह वास्तविक छवि में उच्च औसत पृष्ठभूमि मूल्य का कारण बनता है। इस अंतर को एसएनआर का मिलान करके और पृष्ठभूमि मूल्य को इस तरह सेट करके कम किया जाता है कि यह देखे गए वास्तविक मूल्यों से मेल खाता है। (ii) उपकोशिकीय संरचनाओं की गति और फोटोकाइनेटिक्स प्रणाली में गतिशीलता के दो स्रोत हैं। जीवित कोशिकाओं में चलती संरचनाएं (जो कुछ मिलीसेकंड की सीमा में चलती हैं) गति धुंधला हो जाती हैं। धुंधले प्रभाव से बचने के लिए वास्तविक डेटा अधिग्रहण के दौरान एक्सपोजर समय कम हो जाता है। दूसरी ओर, हम टाइमलैप्स का अनुकरण नहीं करते हैं और गतिहीन संरचनाओं को मानते हैं; यह धारणा तब मान्य होती है जब वास्तविक डेटा में एक्सपोजर समय छोटा होता है। हालांकि, यह धारणा आउटपुट में त्रुटि पैदा कर सकती है यदि वास्तविक डेटा का एक्सपोजर समय गति धुंधला पेश करने के लिए पर्याप्त बड़ा है। दूसरी ओर, फोटोकाइनेटिक्स माइक्रोसेकंड के लिए नैनोसेकंड के क्रम में है और सिमुलेशन में छोड़ा जा सकता है, क्योंकि प्रयोगों के सामान्य एक्सपोजर समय फोटोकाइनेटिक्स के प्रभावों को औसत करने के लिए पर्याप्त (मिलीसेकंड के क्रम में) हैं। (iii) माइक्रोस्कोप छवियों में शोर के अलग-अलग स्रोत होते हैं, और इन स्रोतों में अलग-अलग संभाव्यता घनत्व कार्य होते हैं। शोर के इन व्यक्तिगत स्रोतों को मॉडलिंग करने के बजाय, हम इसे एक निरंतर पृष्ठभूमि पर गॉसियन शोर के रूप में अनुमानित करते हैं। यह अंतर कम सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात (2-4 की सीमा में) की स्थितियों के लिए डेटा वितरण को महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदलता है और फ्लोरोफोरेस¹ के मैक्रो घनत्व से निपटते समय। (iv) इमेजिंग में कलाकृतियां विपथन, बहाव और व्यवस्थित धुंध से उत्पन्न हो सकती हैं। हम माइक्रोस्कोप को अच्छी तरह से संरेखित मानते हैं और वास्तविक डेटा में विश्लेषण के लिए चुने गए क्षेत्र इन कलाकृतियों से रहित हैं। पीएसएफ ^18,19,20 में इनमें से कुछ कलाकृतियों को मॉडलिंग करने की संभावना भी है।

घनी आबादी वाली संरचनाएं
नेटवर्क से ओवरलैपिंग रॉड को अलग करने में सक्षम नहीं होने के साथ कठिनाइयां 2 डी माइक्रोस्कोपी डेटा के विभाजन में एक लगातार समस्या है। चित्रा 5 में एक अत्यंत चुनौतीपूर्ण परिदृश्य प्रस्तुत किया गया है, जहां माइटोकॉन्ड्रिया घनी पैक होते हैं, जो विभाजन मॉडल और निम्नलिखित विश्लेषण में उप-इष्टतम परिणामों की ओर जाता है। इस चुनौती के बावजूद, कंकालीकरण को पतला करने के लिए ऐसी स्थितियों में रूपात्मक ऑपरेटरों का उपयोग करने से इन अत्यधिक जुड़े नेटवर्क को तोड़ने में मदद मिल सकती है, जबकि सभी माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान श्रेणियों में महत्वपूर्ण परिवर्तनों का अभी भी पता लगाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इमेजिंग के लिए वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप के बजाय कॉन्फोकल का उपयोग आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को समाप्त करके इस समस्या को आंशिक रूप से कम करने का एक तरीका है। इसके अलावा, भविष्य में, रॉड जैसे माइटोकॉन्ड्रिया से प्रतिच्छेद (यानी, शारीरिक रूप से एक नेटवर्क बनाते हैं) को अलग करने के लिए 3 डी विभाजन करना उपयोगी होगा, जिनके एक विमान में अनुमान एक दूसरे के साथ ओवरलैप होते हैं।

डीप-लर्निंग विभाजन एक आशाजनक उपकरण है जो माइक्रोस्कोपी उपयोगकर्ताओं की विश्लेषण क्षमताओं का विस्तार करने की पेशकश करता है, इस प्रकार जटिल डेटा और बड़े मात्रात्मक डेटासेट के स्वचालित विश्लेषण की संभावना खोलता है, जो पहले अप्रबंधनीय होता।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि इस लेख से संबंधित हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक आरिफ अहमद शेख के साथ चर्चा को स्वीकार करते हैं। ज़म्बरलाल भुजबल को स्थिर H9c2 कोशिकाओं के निर्माण में मदद करने के लिए स्वीकार किया जाता है। हम निम्नलिखित वित्त पोषण को स्वीकार करते हैं: ईआरसी अनुदान संख्या 804233 (केए को), वैज्ञानिक नवीकरण अनुदान संख्या 325741 के लिए शोधकर्ता परियोजना (डीकेपी को), उत्तरी नॉर्वे क्षेत्रीय स्वास्थ्य प्राधिकरण अनुदान संख्या एचएनएफ 1449-19 (एबीबी), और यूआईटी की विषयगत वित्त पोषण परियोजना वर्चुअलस्टेन के साथ क्रिस्टिन प्रोजेक्ट आईडी 2061348 (डी.के.पी., ए.बी.बी.बी., के.ए., और ए.एच.)।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plate	FALCON	353043
Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25%	Electron Microscopy Sciences	16200
Axio Vert.A1	Zeiss		Brightfield microscope
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Computer	n/a	n/a	Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory
Coverslips	VWR	631-0150
DAPI (stain)	Sigma-Aldrich	D9542
DMEM	gibco	11966-025
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Glass Slides (frosted edge)	epredia	AA00000112E01MNZ10
H9c2 mCherry-EGFP-OMP25			In-house stable cell line derived from purchased cell line
Incubator	Thermo Fisher Scientific	51033557
LSM 800	Zeiss		Confocal Microscope
Mounting Media (Glass)	Thermo Fisher Scientific	P36980
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Thermo Fisher Scientific	J19943-K2
Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4	Zeiss	420782-9900-000
Sterile laminar flow hood	Labogene		SCANLAF MARS
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Vacusafe aspiration system	VACUUBRAND	20727400
ZEN 2.6	Zeiss