Den här artikeln förklarar hur man använder simuleringsövervakad maskininlärning för att analysera mitokondrimorfologi i fluorescensmikroskopibilder av fasta celler.
Den kvantitativa analysen av subcellulära organeller såsom mitokondrier i cellfluorescensmikroskopibilder är en krävande uppgift på grund av de inneboende utmaningarna i segmenteringen av dessa små och morfologiskt olika strukturer. I den här artikeln demonstrerar vi användningen av en maskininlärningsstödd segmenterings- och analyspipeline för kvantifiering av mitokondriell morfologi i fluorescensmikroskopibilder av fasta celler. Det djupinlärningsbaserade segmenteringsverktyget tränas på simulerade bilder och eliminerar kravet på grundläggande sanningsanteckningar för övervakad djupinlärning. Vi demonstrerar nyttan av detta verktyg på fluorescensmikroskopibilder av fasta kardiomyoblaster med ett stabilt uttryck av fluorescerande mitokondrimarkörer och använder specifika cellodlingsförhållanden för att inducera förändringar i mitokondriell morfologi.
I den här artikeln demonstrerar vi nyttan av ett fysikbaserat maskininlärningsverktyg för subcellulär segmentering1 i fluorescensmikroskopibilder av fasta kardiomyoblaster som uttrycker fluorescerande mitokondrimarkörer.
Mitokondrier är de viktigaste energiproducerande organellerna i däggdjursceller. Specifikt är mitokondrier mycket dynamiska organeller och finns ofta i nätverk som ständigt förändras i längd och förgrening. Mitokondriernas form påverkar deras funktion, och celler kan snabbt ändra sin mitokondriella morfologi för att anpassa sig till en förändring i miljön2. För att förstå detta fenomen är den morfologiska klassificeringen av mitokondrier som prickar, stavar eller nätverk mycket informativ3.
Segmenteringen av mitokondrier är avgörande för analysen av mitokondriell morfologi i celler. Nuvarande metoder för att segmentera och analysera fluorescensmikroskopibilder av mitokondrier förlitar sig på manuell segmentering eller konventionella bildbehandlingsmetoder. Tröskelbaserade metoder som Otsu4 är mindre exakta på grund av de höga ljudnivåerna i mikroskopibilder. Vanligtvis har bilder för morfologisk analys av mitokondrier ett stort antal mitokondrier, vilket gör manuell segmentering tråkig. Matematiska tillvägagångssätt som MorphoLibJ5 och semi-övervakade maskininlärningsmetoder som Weka6 är mycket krävande och kräver expertkunskap. En genomgång av bildanalysteknikerna för mitokondrier7 visade att djupinlärningsbaserade tekniker kan vara användbara för uppgiften. Faktum är att bildsegmentering i vardagsbilder för applikationer som självkörning har revolutionerats med hjälp av djupinlärningsbaserade modeller.
Djupinlärning är en delmängd av maskininlärning som tillhandahåller algoritmer som lär sig av stora mängder data. Övervakade djupinlärningsalgoritmer lär sig relationer från stora uppsättningar bilder som är kommenterade med sina GT-etiketter (ground truth). Utmaningarna med att använda övervakad djupinlärning för att segmentera mitokondrier i fluorescensmikroskopibilder är tvåfaldiga. För det första kräver övervakad djupinlärning en stor datauppsättning med träningsbilder, och när det gäller fluorescensmikroskopi skulle det vara en omfattande uppgift att tillhandahålla denna stora datauppsättning jämfört med när man använder mer lättillgängliga traditionella kamerabaserade bilder. För det andra kräver fluorescensmikroskopibilder GT-anteckningar av föremålen av intresse för träningsbilderna, vilket är en tråkig uppgift som kräver expertkunskap. Denna uppgift kan enkelt ta timmar eller dagar av expertens tid för en enda bild av celler med fluorescerande märkta subcellulära strukturer. Dessutom utgör variationer mellan annotatorer ett problem. För att ta bort behovet av manuell anteckning och för att kunna utnyttja den överlägsna prestandan hos djupinlärningstekniker användes en djupinlärningsbaserad segmenteringsmodell här som tränades på simulerade bilder. Fysikbaserade simulatorer ger ett sätt att efterlikna och kontrollera processen för bildbildning i ett mikroskop, vilket möjliggör skapandet av bilder av kända former. Med hjälp av en fysikbaserad simulator skapades en stor datauppsättning med simulerade fluorescensmikroskopibilder av mitokondrier för detta ändamål.
Simuleringen börjar med geometrigenereringen med hjälp av parametriska kurvor för formgenerering. Emittrar placeras slumpmässigt på formens yta på ett jämnt fördelat sätt så att densiteten matchar de experimentella värdena. Mikroskopets 3D-punktspridningsfunktion (PSF) beräknas med hjälp av en beräkningseffektiv approximation8 av Gibson-Lanni-modellen9. För att nära matcha de simulerade bilderna med experimentella bilder emuleras både den mörka strömmen och det tagna bruset för att uppnå fotorealism. Den fysiska GT genereras i form av en binär karta. Koden för att generera datauppsättningen och träna simuleringsmodellen är tillgänglig10, och steget för att skapa den här simulerade datauppsättningen beskrivs i bild 1.
Vi visar nyttan av djupinlärningsbaserad segmentering som tränas helt på en simulerad datauppsättning genom att analysera konfokalmikroskopibilder av fasta kardiomyoblaster. Dessa kardiomyoblaster uttryckte en fluorescerande markör i det mitokondriella yttre membranet, vilket möjliggjorde visualisering av mitokondrierna i fluorescensmikroskopibilderna. Innan experimentet genomfördes som ett exempel här, berövades cellerna glukos och anpassades till galaktos i 7 dagar i odling. Att ersätta glukos i tillväxtmediet med galaktos tvingar cellerna i odling att bli mer oxidativa och därmed beroende av sina mitokondrier för energiproduktion11,12. Dessutom gör detta cellerna mer känsliga för mitokondriell skada. Mitokondriella morfologiska förändringar kan induceras experimentellt genom att tillsätta ett mitokondriellt frikopplingsmedel såsom karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) till cellodlingsmediet13. CCCP leder till en förlust av mitokondriell membranpotential (ΔΨm) och resulterar därmed i förändringar i mitokondrierna från en mer rörformig (stavliknande) till en mer globulär (prickliknande) morfologi14. Dessutom tenderar mitokondrier att svälla under CCCP-behandling15. Vi visar den morfologiska fördelningen av mitokondrier när de galaktosanpassade kardiomyoblasterna behandlades med mitokondriell frikoppling CCCP. Mitokondriernas djupinlärningssegmenteringar gjorde det möjligt för oss att klassificera dem som prickar, stavar eller nätverk. Vi härledde sedan kvantitativa mätvärden för att bedöma grenlängderna och överflödet av de olika mitokondriella fenotyperna. Stegen i analysen beskrivs i figur 2, och detaljerna i cellkulturen, avbildning, datasetskapande för djupinlärningsbaserad segmentering, samt den kvantitativa analysen av mitokondrierna, ges nedan.
Vi diskuterar försiktighetsåtgärder relaterade till de kritiska stegen i protokollet i styckena om “geometrigenerering” och “simulatorparametrar”. Stycket med titeln “överföringsinlärning” diskuterar modifieringar för högre genomströmning vid anpassning till flera mikroskop. Styckena om “partikelanalys” och “generering av andra subcellulära strukturer” hänvisar till framtida tillämpningar av denna metod. Stycket om “skillnaden från biologisk sanning” diskuterar de olika orsakerna till att simuleringarna kan skilja sig från verkliga data och om dessa skäl påverkar vår tillämpning. Slutligen diskuterar vi ett utmanande scenario för vår metod i stycket “tätt packade strukturer”.
Generering av geometri
För att generera mitokondriernas 3D-geometri fungerar en enkel 2D-struktur skapad av b-splinekurvor som skelett bra för skapandet av den syntetiska datauppsättningen. Dessa syntetiska former efterliknar nära formerna av mitokondrier som observerats i 2D-cellkulturer. Men när det gäller 3D-vävnad, såsom hjärtvävnad, är mitokondriernas form och arrangemang ganska olika. I sådana fall kan segmenteringsmodellens prestanda förbättras med tillägg av riktning i de simulerade bilderna.
Simulator parametrar
Försiktighet bör iakttas när du ställer in parametrarna för simulatorn för att säkerställa att de matchar de data som ska köras härledningen, eftersom underlåtenhet att göra detta kan leda till lägre prestanda vid segmentering. En sådan parameter är signal-brusförhållandet (SNR). Intervallet för SNR för de data som ska testas bör matcha värdena för den simulerade datauppsättningen. Dessutom bör den polyesterstapelfibrer som används matcha den för måltestdata. Modelltränade bilder från en konfokal polyesterstapelfibrer bör till exempel inte användas för att testa bilder från ett epifluorescerande mikroskop. En annan parameter att vara uppmärksam på är användningen av ytterligare förstoring i testdata. Om ytterligare förstoring har använts i testdata bör simulatorn också ställas in på lämpligt sätt.
Överför lärande
Överföringsinlärning är fenomenet att utnyttja en inlärd modell som tränats på en uppgift för användning i en annan uppgift. Detta fenomen är också tillämpligt på vårt problem i förhållande till olika typer av mikroskopdata. Vikterna för segmenteringsmodellen (som medföljer källkoden) som tränas på en typ av mikroskopidata kan användas för att initiera en segmenteringsmodell som ska användas på en annan typ av optiska mikroskopdata. Detta gör att vi kan träna på en betydligt mindre delmängd av träningsdatauppsättningen (3 000 bilder jämfört med 10 000), vilket minskar beräkningskostnaderna för simulering.
Partikelanalys
Partikelanalys kan också utföras på de segmenterade maskerna. Detta kan ge information om området och krökningen etc. för de enskilda mitokondrierna. Denna information kan också fungera som mätvärden för kvantitativ jämförelse av mitokondrier (används inte för detta experiment). Till exempel definierar vi för närvarande punktmorfologin med hjälp av ett tröskelvärde baserat på mitokondriernas längd. Det kan i vissa fall vara användbart att införliva ellipticitet för att bättre separera små stavliknande mitokondrier från puncta eller prickliknande mitokondrier. Alternativt, om vissa biologiska förhållanden får mitokondrierna att krulla upp, kan krökningskvantifiering vara av intresse för att analysera mitokondriell population.
Generera andra subcellulära strukturer
Den fysikbaserade segmenteringen av subcellulära strukturer har demonstrerats för mitokondrier och vesiklar1. Även om vesiklar uppvisar varierande former, är deras storlekar mindre och de verkar som enkla sfärer när de observeras genom ett fluorescensmikroskop. Därför simuleras vesiklarnas geometri med hjälp av sfäriska strukturer med ett lämpligt diameterområde. Detta innebär att en förändring i funktionen genererar geometrin (cylindrar i fallet med mitokondrier och sfärer i fallet med vesiklar) av strukturerna och respektive parametrar (steg 5.4 i protokollavsnittet). Geometriskt har endoplasmatisk retikulum och mikrotubuli också simulerats som rörformiga strukturer17. Modellering av endoplasmatisk retikulum med en diameter på 150 nm och mikrotubuli med en genomsnittlig ytterdiameter på 25 nm och ett inre ihåligt rör med en diameter på 15 nm ger approximationer av formerna för dessa strukturer. En annan parameter som varierar för var och en av dessa subcellulära strukturer är fluorofordensiteten. Detta beräknas baserat på fördelningen av biomolekylen till vilken fluoroforerna binder och sannolikheten för bindning.
Skillnad från biologisk grundsanning
De simulerade data som används för simuleringsövervakad träning av djupinlärningsmodellen skiljer sig från verkliga data på många sätt. (i) Frånvaron av icke-specifik märkning i simulerade data skiljer sig från verkliga data, eftersom det ofta finns fritt flytande fluoroforer i de verkliga data. Detta orsakar ett högre genomsnittligt bakgrundsvärde i den verkliga bilden. Denna skillnad minimeras genom att matcha SNR och ställa in bakgrundsvärdet så att det matchar de observerade verkliga värdena. (ii) Rörelsen av subcellulära strukturer och fotokinetik är två källor till dynamik i systemet. Rörliga strukturer i levande celler (som rör sig i intervallet några millisekunder) orsakar rörelseoskärpa. Exponeringstiden reduceras under verklig datainsamling för att undvika suddighetseffekten. Å andra sidan simulerar vi inte timelapse och antar orörliga strukturer; Detta antagande är giltigt när exponeringstiden i de verkliga uppgifterna är liten. Detta antagande kan dock ge ett fel i utdata om exponeringstiden för de verkliga data är tillräckligt stor för att införa rörelseoskärpa. Fotokinetik, å andra sidan, är i storleksordningen nanosekunder till mikrosekunder och kan utelämnas i simuleringen, eftersom de vanliga exponeringstiderna för experiment är tillräckligt långa (i storleksordningen millisekunder) för att medelvärdet av effekterna av fotokinetik. (iii) Brus i mikroskopbilder har olika källor, och dessa källor har olika sannolikhetstäthetsfunktioner. Istället för att modellera dessa enskilda ljudkällor, approximerar vi det som ett gaussiskt brus över en konstant bakgrund. Denna skillnad förändrar inte signifikant datafördelningen för förhållandena med lågt signal-till-bakgrundsförhållande (i intervallet 2-4) och vid hantering av makrodensiteten hos fluoroforer1. (iv) Artefakter i avbildning kan uppstå från avvikelser, drift och systematiska oskärpa. Vi antar att mikroskopet är väl anpassat och att de regioner som valts för analys i de verkliga uppgifterna saknar dessa artefakter. Det finns också möjlighet att modellera några av dessa artefakter i PSF18,19,20.
Tätt packade strukturer
Svårigheterna med att inte kunna skilja överlappande stavar från nätverk är ett ihållande problem i segmenteringen av 2D-mikroskopidata. Ett extremt utmanande scenario presenteras i figur 5, där mitokondrierna är tätt packade, vilket leder till suboptimala resultat i segmenteringsmodellen och följande analys. Trots denna utmaning kan användning av morfologiska operatörer i sådana situationer för att slimma skelettiseringen hjälpa till att bryta dessa alltför anslutna nätverk samtidigt som betydande förändringar i alla mitokondriella morfologikategorier fortfarande kan detekteras. Dessutom är användningen av ett konfokalt snarare än ett widefield-mikroskop för avbildning en metod för att delvis mildra detta problem genom att eliminera ljus utanför fokus. Vidare skulle det i framtiden vara användbart att utföra 3D-segmentering för att skilja mitokondrier som skär varandra (dvs fysiskt bildar ett nätverk) från stavliknande mitokondrier vars utsprång i ett enda plan överlappar varandra.
Djupinlärningssegmentering är ett lovande verktyg som erbjuder att utöka mikroskopianvändarnas analysfunktioner, vilket öppnar möjligheten till automatiserad analys av komplexa data och stora kvantitativa datamängder, vilket tidigare skulle ha varit oöverskådligt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner diskussionen med Arif Ahmed Sekh. Zambarlal Bhujabal är erkänt för att ha hjälpt till med att konstruera de stabila H9c2-cellerna. Vi erkänner följande finansiering: ERC starting grant no. 804233 (till K.A.), Researcher Project for Scientific Renewal grant no. 325741 (till D.K.P.), Northern Norway Regional Health Authority grant no. HNF1449-19 (Å.B.B.) och UiT:s tematiska finansieringsprojekt VirtualStain med Cristin Project ID 2061348 (D.K.P., Å.B.B., K.A. och A.H.).
12-well plate | FALCON | 353043 | |
Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
Axio Vert.A1 | Zeiss | Brightfield microscope | |
CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
Computer | n/a | n/a | Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory |
Coverslips | VWR | 631-0150 | |
DAPI (stain) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
DMEM | gibco | 11966-025 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Glass Slides (frosted edge) | epredia | AA00000112E01MNZ10 | |
H9c2 mCherry-EGFP-OMP25 | In-house stable cell line derived from purchased cell line | ||
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51033557 | |
LSM 800 | Zeiss | Confocal Microscope | |
Mounting Media (Glass) | Thermo Fisher Scientific | P36980 | |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | J19943-K2 | |
Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4 | Zeiss | 420782-9900-000 | |
Sterile laminar flow hood | Labogene | SCANLAF MARS | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Vacusafe aspiration system | VACUUBRAND | 20727400 | |
ZEN 2.6 | Zeiss |