تصور بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض عن طريق فحوصات التألق المناعي
Summary
يصف البروتوكول الحالي طرق تقييم بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض. يتضمن هنا طرق الطلاء والتلوين الشاملة ، بالإضافة إلى إجراءات القياس الكمي التفصيلية والموضوعية.
Abstract
يعد التألق المناعي أحد أكثر التقنيات استخداما لتصور المستضدات المستهدفة ذات الحساسية العالية والنوعية ، مما يسمح بالتحديد الدقيق وتوطين البروتينات والجليكان والجزيئات الصغيرة. في حين أن هذه التقنية راسخة في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن استخدامها في نماذج الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D). عضويات سرطان المبيض هي نماذج ورم 3D تلخص عدم تجانس الخلايا السرطانية النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. وبالتالي ، فهي متفوقة على خطوط الخلايا لتقييم حساسية الدواء والمؤشرات الحيوية الوظيفية. لذلك ، فإن القدرة على استخدام التألق المناعي على عضويات سرطان المبيض الأولية مفيدة للغاية في فهم بيولوجيا هذا السرطان. تصف الدراسة الحالية تقنية التألق المناعي للكشف عن بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المصلية عالية الجودة المشتقة من المريض (PDOs). بعد تعريض PDOs للإشعاع المؤين ، يتم إجراء التألق المناعي على المواد العضوية السليمة لتقييم البروتينات النووية كبؤر. يتم جمع الصور باستخدام تصوير z-stack على الفحص المجهري متحد البؤر وتحليلها باستخدام برنامج حساب البؤر الآلي. تسمح الطرق الموصوفة بتحليل التوظيف الزمني والخاص لبروتينات إصلاح تلف الحمض النووي وتوطين هذه البروتينات مع علامات دورة الخلية.
Introduction
سرطان المبيض هو السبب الرئيسي للوفاة بسبب الأورام الخبيثة النسائية. يتم علاج غالبية المرضى بالأدوية الضارة بالحمض النووي مثل كاربوبلاتين ، ويمكن إعطاء أولئك الذين يعانون من نقص في إصلاح إعادة التركيب المتماثل (HRR) مثبطات بوليميراز بولي (ADP-ribose) (PARP) 1,2. ومع ذلك ، فإن معظم المرضى يطورون مقاومة لهذه العلاجات ويموتون في غضون 5 سنوات من التشخيص. ارتبط عدم تنظيم استجابة تلف الحمض النووي (DDR) بتطور سرطان المبيض ومقاومة كل من العلاج الكيميائي ومثبطات PARP3. وبالتالي ، فإن دراسة نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج أمر حتمي في فهم الفيزيولوجيا المرضية لسرطان المبيض ، والمؤشرات الحيوية المحتملة ، والعلاجات المستهدفة الجديدة.
تستخدم الطرق الحالية لتقييم نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج التألق المناعي (IF) ، حيث يسمح ذلك بالتحديد الدقيق وتوطين بروتينات تلف الحمض النووي ونظائر النوكليوتيدات. بمجرد حدوث كسر مزدوج تقطعت به السبل (DSB) في الحمض النووي ، يتم فسفرة بروتين هيستون H2AX بسرعة ، مما يشكل تركيزا حيث تتجمع بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي4. يمكن تحديد هذه الفسفرة بسهولة باستخدام IF. في الواقع ، تم استخدام اختبار ɣ-H2AX بشكل شائع لتأكيد تحريض DSB5،6،7،8،9. ارتبط تلف الحمض النووي المتزايد بحساسية البلاتين وفعالية العوامل الضارة بالحمض النووي10،11،12 ، وقد تم اقتراح ɣ-H2AX كعلامة حيوية مرتبطة باستجابة العلاج الكيميائي في علاجات السرطان الأخرى 13. عند DSB ، تقوم الخلية التي تتقن HRR بإجراء سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى تجنيد BRCA1 و BRCA2 RAD51 ليحل محل بروتين النسخ المتماثل A (RPA) ويرتبط بالحمض النووي. يستخدم إصلاح HRR قالب الحمض النووي لإصلاح DSB بأمانة. ومع ذلك ، عندما تكون الأورام ناقصة في HRR ، فإنها تعتمد على مسارات إصلاح بديلة مثل الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ). من المعروف أن NHEJ عرضة للخطأ ويخلق عبئا طفريا كبيرا على الخلية ، والتي تستخدم 53BP1 كمنظم إيجابي14. يمكن تحديد جميع بروتينات تلف الحمض النووي هذه بدقة على أنها بؤر باستخدام IF. بالإضافة إلى تلطيخ البروتينات ، يمكن استخدام IF لدراسة حماية الشوكة وتشكيل فجوة الحمض النووي التي تقطعت بها السبل. ارتبطت القدرة على الحصول على شوكات مستقرة باستجابة البلاتين ، ومؤخرا ، أظهرت فحوصات الفجوة إمكانية التنبؤ بالاستجابة لمثبطات PARP6،15،16،17. لذلك ، فإن تلطيخ نظائر النوكليوتيدات بعد إدخالها في الجينوم هو طريقة أخرى لدراسة DDR.
حتى الآن ، اقتصر تقييم DDR في سرطان المبيض إلى حد كبير على خطوط خلايا 2D المتجانسة التي لا تلخص عدم التجانس النسيلي أو البيئة المكروية أو بنية الأورام في الجسم الحي 18,19. تشير الأبحاث الحديثة إلى أن الكائنات العضوية تتفوق على خطوط خلايا 2D في دراسة العمليات البيولوجية المعقدة مثل آليات DDR6. تقيم المنهجية الحالية RAD51 و ɣ-H2AX و 53BP1 و RPA و geminin في PDOs. تقوم هذه الطرق بتقييم العضو العضوي السليم وتسمح بدراسة آليات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في بيئة أكثر تشابها مع البيئة المكروية للورم في الجسم الحي. جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر والعد الآلي للبؤر ، يمكن أن تساعد هذه المنهجية في فهم مسار نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في سرطان المبيض وتخصيص خطط العلاج للمرضى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تلعب استجابة تلف الحمض النووي دورا أساسيا في كل من تطور سرطان المبيض ومقاومة العلاج الكيميائي. لذلك ، فإن الفهم الشامل لآليات إصلاح الحمض النووي أمر حتمي. هنا ، يتم تقديم منهجية لدراسة بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في 3D ، عضويات سليمة. تم تطوير بروتوكول موثوق وقابل للتكرار باستخدام الأج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لتوجيهات بافل لوباتشيفسكي ، دكتوراه في إنشاء هذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لكلية الطب بجامعة واشنطن في قسم أمراض النساء والتوليد في سانت لويس وقسم الأورام النسائية ، وبرنامج العميد للباحثين بجامعة واشنطن ، ومؤسسة مجموعة الأورام النسائية ، وبرنامج تطوير علماء الإنجاب لدعمهم لهذا المشروع.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O’Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
