Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests
Summary
Het huidige protocol beschrijft methoden voor het evalueren van DNA-schadehersteleiwitten in van patiënten afgeleide eierstokkankerorganoïden. Hier zijn uitgebreide plating- en kleuringsmethoden opgenomen, evenals gedetailleerde, objectieve kwantificeringsprocedures.
Abstract
Immunofluorescentie is een van de meest gebruikte technieken om doelantigenen met een hoge gevoeligheid en specificiteit te visualiseren, waardoor de nauwkeurige identificatie en lokalisatie van eiwitten, glycanen en kleine moleculen mogelijk is. Hoewel deze techniek goed ingeburgerd is in tweedimensionale (2D) celcultuur, is er minder bekend over het gebruik ervan in driedimensionale (3D) celmodellen. Eierstokkankerorganoïden zijn 3D-tumormodellen die de klonale heterogeniteit van tumorcellen, de micro-omgeving van de tumor en cel-cel- en cel-matrixinteracties samenvatten. Ze zijn dus superieur aan cellijnen voor de evaluatie van medicijngevoeligheid en functionele biomarkers. Daarom is het vermogen om immunofluorescentie te gebruiken op primaire eierstokkankerorganoïden uiterst gunstig voor het begrijpen van de biologie van deze kanker. De huidige studie beschrijft de techniek van immunofluorescentie om DNA-schadehersteleiwitten te detecteren in hoogwaardige sereuze patiënt-afgeleide ovariumkankerorganoïden (PDO’s). Na blootstelling van de BOB’s aan ioniserende straling, wordt immunofluorescentie uitgevoerd op intacte organoïden om nucleaire eiwitten als foci te evalueren. Beelden worden verzameld met behulp van z-stack imaging op confocale microscopie en geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde foci-telsoftware. De beschreven methoden maken de analyse van temporele en speciale rekrutering van DNA-schadehersteleiwitten en colocalisatie van deze eiwitten met celcyclusmarkers mogelijk.
Introduction
Eierstokkanker is de belangrijkste doodsoorzaak als gevolg van gynaecologische maligniteit. De meerderheid van de patiënten wordt behandeld met DNA-beschadigende geneesmiddelen zoals carboplatine, en degenen met homologe recombinatieherstel (HRR)-deficiënte tumoren kunnen poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) -remmers 1,2 krijgen. De meeste patiënten ontwikkelen echter resistentie tegen deze therapieën en sterven binnen 5 jaar na de diagnose. Ontregeling van de DNA-schaderespons (DDR) is in verband gebracht met de ontwikkeling van eierstokkanker en zowel chemotherapie als PARP-remmerresistentie3. Studie van de DDR is dus noodzakelijk om de pathofysiologie van eierstokkanker, potentiële biomarkers en nieuwe gerichte therapieën te begrijpen.
De huidige methoden om de DDR te evalueren maken gebruik van immunofluorescentie (IF), omdat dit de nauwkeurige identificatie en lokalisatie van DNA-schade-eiwitten en nucleotide-analogen mogelijk maakt. Zodra er een dubbelstrengsbreuk (DSB) in het DNA is, wordt het histoneiwit H2AX snel gefosforyleerd en vormt het een focus waar DNA-schadehersteleiwitten samenkomen4. Deze fosforylering kan eenvoudig worden geïdentificeerd met behulp van IF; in feite is de ɣ-H2AX-test vaak gebruikt om de inductie van een DSB 5,6,7,8,9 te bevestigen. Verhoogde DNA-schade is in verband gebracht met platinagevoeligheid en werkzaamheid van DNA-schadelijke stoffen 10,11,12, en ɣ-H2AX is voorgesteld als een biomarker geassocieerd met chemotherapierespons in andere kankerbehandelingen 13. Bij een DSB voert een cel die bedreven is in HRR een reeks gebeurtenissen uit die ertoe leiden dat BRCA1 en BRCA2 RAD51 rekruteren om replicatie-eiwit A (RPA) te vervangen en aan het DNA te binden. HRR-reparatie maakt gebruik van een DNA-sjabloon om de DSB getrouw te repareren. Wanneer tumoren echter een tekort aan HRR hebben, vertrouwen ze op alternatieve reparatieroutes zoals niet-homologe eindverbinding (NHEJ). Van NHEJ is bekend dat het foutgevoelig is en een hoge mutatiebelasting op de cel creëert, die 53BP1 als positieve regulatorgebruikt 14. Deze DNA-schade-eiwitten kunnen allemaal nauwkeurig worden geïdentificeerd als foci met behulp van IF. Naast kleuring voor eiwitten, kan IF worden gebruikt om vorkbescherming en enkelstrengs DNA-kloofvorming te bestuderen. Het vermogen om stabiele vorken te hebben is gecorreleerd met platinarespons en onlangs hebben gap-assays het potentieel aangetoond om de respons op PARP-remmers 6,15,16,17 te voorspellen. Daarom is kleuring voor de nucleotide-analogen na introductie in het genoom een andere manier om de DDR te bestuderen.
Tot op heden is de evaluatie van de DDR bij eierstokkanker grotendeels beperkt gebleven tot homogene 2D-cellijnen die de klonale heterogeniteit, micro-omgeving of architectuur van in vivo tumoren niet samenvatten18,19. Recent onderzoek suggereert dat organoïden superieur zijn aan 2D-cellijnen bij het bestuderen van complexe biologische processen zoals DDR-mechanismen6. De huidige methodologie evalueert RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA en geminin in BOB’s. Deze methoden beoordelen de intacte organoïde en maken de studie van DDR-mechanismen mogelijk in een omgeving die meer lijkt op de in vivo tumormicro-omgeving. Samen met confocale microscopie en geautomatiseerde foci-telling kan deze methodologie helpen bij het begrijpen van de DDR-route bij eierstokkanker en het personaliseren van behandelplannen voor patiënten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De DNA-schaderespons speelt een integrale rol bij zowel de ontwikkeling van eierstokkanker als chemotherapieresistentie. Daarom is een grondig begrip van DNA-reparatiemechanismen noodzakelijk. Hier wordt een methodologie gepresenteerd om DNA-schadehersteleiwitten in 3D, intacte organoïden te bestuderen. Een reproduceerbaar, betrouwbaar protocol wordt ontwikkeld met behulp van kenmerkende antilichamen om DNA-schade, homologe recombinatie, niet-homologe eindverbinding en replicatiestress te evalueren. Belangrijk is dat de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de begeleiding van Pavel Lobatsjevski, PhD bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University’s School of Medicine in St. Louis’s Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University’s Dean’s Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation en het Reproductive Scientist Development Program bedanken voor hun steun aan dit project.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O’Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
