הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להערכת חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. להלן שיטות ציפוי וצביעה מקיפות, כמו גם הליכי כימות מפורטים ואובייקטיביים.
Abstract
Immunofluorescence היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר כדי לדמיין אנטיגנים המטרה עם רגישות גבוהה וספציפיות, המאפשר זיהוי מדויק לוקליזציה של חלבונים, גליקנים, מולקולות קטנות. בעוד טכניקה זו מבוססת היטב בתרבית תאים דו-ממדית (2D), פחות ידוע על השימוש בה במודלים תלת-ממדיים (3D) של תאים. אורגנואידים של סרטן השחלות הם מודלים תלת-ממדיים של גידולים המשחזרים הטרוגניות של תאי גידול, מיקרו-סביבה של הגידול ואינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים. לפיכך, הם עדיפים על קווי תאים להערכת רגישות לתרופות וסמנים ביולוגיים פונקציונליים. לכן, היכולת לנצל אימונופלואורסנציה על אורגנואידים ראשוניים של סרטן השחלות מועילה ביותר בהבנת הביולוגיה של סרטן זה. המחקר הנוכחי מתאר את הטכניקה של אימונופלואורסנציה לזיהוי חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות (PDOs) שמקורם בחולה סרוס ברמה גבוהה. לאחר חשיפת PDOs לקרינה מייננת, immunofluorescence מבוצעת על אורגנואידים שלמים כדי להעריך חלבונים גרעיניים כמוקדים. התמונות נאספות באמצעות הדמיית z-stack במיקרוסקופ קונפוקלי ומנותחות באמצעות תוכנה אוטומטית לספירת מוקדים. השיטות המתוארות מאפשרות ניתוח של גיוס זמני ומיוחד של חלבונים לתיקון נזקי DNA וקולוקליזציה של חלבונים אלה עם סמנים של מחזור התא.
Introduction
סרטן השחלות הוא סיבת המוות המובילה עקב ממאירות גינקולוגית. רוב החולים מטופלים בתרופות הפוגעות בדנ”א כגון קרבופלטין, ואלה עם גידולים הומולוגיים עם תיקון רקומבינציה הומולוגית (HRR) יכולים לקבל מעכבי פולי (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP) 1,2. עם זאת, רוב החולים מפתחים עמידות לטיפולים אלה ומתים תוך 5 שנים מהאבחון. חוסר ויסות של תגובת הנזק לדנ”א (DDR) נקשר להתפתחות סרטן השחלות ולכימותרפיה ולעמידות למעכבי PARP3. לפיכך, מחקר של DDR הוא הכרחי להבנת הפתופיזיולוגיה של סרטן השחלות, סמנים ביולוגיים פוטנציאליים, וטיפולים ממוקדים חדשניים.
השיטות הנוכחיות להערכת DDR משתמשות באימונופלואורסנציה (IF), מכיוון שהדבר מאפשר זיהוי מדויק ולוקליזציה של חלבונים הפוגעים בדנ”א ואנלוגים לנוקלאוטידים. ברגע שיש שבר דו-גדילי (DSB) בדנ”א, חלבון ההיסטון H2AX עובר זרחן מהיר, ויוצר מוקד שבו חלבונים לתיקון נזקי דנ”א מתכנסים4. זרחן זה ניתן לזהות בקלות באמצעות IF; למעשה, בדיקת ɣ-H2AX שימשה בדרך כלל כדי לאשר את האינדוקציה של DSB 5,6,7,8,9. נזק מוגבר לדנ”א נקשר לרגישות פלטינה וליעילות של חומרים המזיקים לדנ”א 10,11,12, ו-ɣ-H2AX הוצע כסמן ביולוגי הקשור לתגובה כימותרפית בטיפולים אחרים בסרטן 13. ב-DSB, תא המיומן ב-HRR מבצע סדרה של אירועים שמובילים לכך ש-BRCA1 ו-BRCA2 מגייסים את RAD51 כדי להחליף את חלבון השכפול A (RPA) ולהיקשר לדנ”א. תיקון HRR משתמש בתבנית DNA כדי לתקן נאמנה את DSB. עם זאת, כאשר גידולים חסרים HRR, הם מסתמכים על מסלולי תיקון חלופיים כגון חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ). NHEJ ידוע כנוטה לטעויות ויוצר עומס מוטציות גבוה על התא, המשתמש ב- 53BP1 כמווסת חיובי14. חלבונים אלה הפוגעים בדנ”א יכולים להיות מזוהים במדויק כמוקדים באמצעות IF. בנוסף לצביעה של חלבונים, ניתן להשתמש ב-IF כדי לחקור הגנה מפני מזלג והיווצרות פער DNA חד-גדילי. היכולת לקבל מזלגות יציבים נמצאה בקורלציה עם תגובת פלטינה, ולאחרונה, מבחני פער הראו את הפוטנציאל לחזות את התגובה למעכבי PARP 6,15,16,17. לכן, צביעה עבור אנלוגים נוקלאוטידים לאחר הקדמה לתוך הגנום היא דרך נוספת ללמוד את DDR.
עד כה, הערכת ה- DDR בסרטן השחלות הוגבלה במידה רבה לקווי תאים דו-ממדיים הומוגניים שאינם משחזרים את ההטרוגניות השבט, המיקרו-סביבה או הארכיטקטורה של גידולי in vivo 18,19. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שאורגנואידים עדיפים על קווי תאים דו-ממדיים בחקר תהליכים ביולוגיים מורכבים כגון מנגנוני DDR6. המתודולוגיה הנוכחית מעריכה RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA וגמינין במחשבי PDO. שיטות אלה מעריכות את האורגנואיד השלם ומאפשרות לחקור מנגנוני DDR בסביבה דומה יותר למיקרו-סביבה של הגידול in vivo. יחד עם מיקרוסקופ קונפוקלי וספירת מוקדים אוטומטית, מתודולוגיה זו יכולה לסייע בהבנת מסלול DDR בסרטן השחלות והתאמה אישית של תוכניות הטיפול למטופלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
תגובת הנזק לדנ”א ממלאת תפקיד אינטגרלי הן בהתפתחות סרטן השחלות והן בעמידות לכימותרפיה. לכן, הבנה מעמיקה של מנגנוני תיקון DNA היא הכרחית. כאן מוצגת מתודולוגיה לחקר חלבונים לתיקון נזקי דנ”א באורגנואידים תלת-ממדיים שלמים. פרוטוקול אמין הניתן לשחזור פותח תוך שימוש בנוגדנים סימן היכר להערכת נזק ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה על הדרכתו של פאבל לובצ’בסקי, PhD בהקמת פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון במחלקה למיילדות וגינקולוגיה בסנט לואיס ולמחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית, לתוכנית מלגות הדיקן של אוניברסיטת וושינגטון, לקרן קבוצת אונקולוגיה גינקולוגית ולתוכנית לפיתוח מדעני פוריות על תמיכתם בפרויקט זה.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O’Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
