Summary

Visualizzazione delle proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi del cancro ovarico derivati dal paziente tramite saggi di immunofluorescenza

Published: February 24, 2023
doi:

Summary

Il presente protocollo descrive i metodi per valutare le proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Qui sono inclusi metodi completi di placcatura e colorazione, nonché procedure di quantificazione dettagliate e oggettive.

Abstract

L’immunofluorescenza è una delle tecniche più utilizzate per visualizzare antigeni bersaglio con elevata sensibilità e specificità, consentendo l’identificazione accurata e la localizzazione di proteine, glicani e piccole molecole. Mentre questa tecnica è ben consolidata nella coltura cellulare bidimensionale (2D), si sa meno del suo uso in modelli cellulari tridimensionali (3D). Gli organoidi del cancro ovarico sono modelli tumorali 3D che ricapitolano l’eterogeneità clonale delle cellule tumorali, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Pertanto, sono superiori alle linee cellulari per la valutazione della sensibilità ai farmaci e dei biomarcatori funzionali. Pertanto, la capacità di utilizzare l’immunofluorescenza sugli organoidi del cancro ovarico primario è estremamente utile per comprendere la biologia di questo cancro. L’attuale studio descrive la tecnica di immunofluorescenza per rilevare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi di cancro ovarico (PDO) sierosi di alto grado derivati da pazienti. Dopo aver esposto le DOP a radiazioni ionizzanti, l’immunofluorescenza viene eseguita su organoidi intatti per valutare le proteine nucleari come focolai. Le immagini vengono raccolte utilizzando l’imaging z-stack al microscopio confocale e analizzate utilizzando un software di conteggio automatico dei fuochi. I metodi descritti consentono l’analisi del reclutamento temporale e speciale di proteine di riparazione del danno al DNA e la colocalizzazione di queste proteine con marcatori del ciclo cellulare.

Introduction

Il cancro ovarico è la principale causa di morte a causa di tumori maligni ginecologici. La maggior parte dei pazienti è trattata con farmaci dannosi per il DNA come il carboplatino, e quelli con tumori con deficit di riparazione della ricombinazione omologa (HRR) possono ricevere inibitori della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) 1,2. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti sviluppa resistenza a queste terapie e muore entro 5 anni dalla diagnosi. La disregolazione della risposta al danno del DNA (DDR) è stata associata allo sviluppo del cancro ovarico e alla chemioterapia e alla resistenza agli inibitori di PARP3. Pertanto, lo studio della DDR è fondamentale per comprendere la fisiopatologia del cancro ovarico, i potenziali biomarcatori e le nuove terapie mirate.

Gli attuali metodi per valutare il DDR utilizzano l’immunofluorescenza (IF), in quanto ciò consente l’identificazione accurata e la localizzazione delle proteine danneggiate dal DNA e degli analoghi nucleotidici. Una volta che c’è una rottura a doppio filamento (DSB) nel DNA, la proteina istonica H2AX viene rapidamente fosforilata, formando un punto focale in cui si riuniscono le proteine di riparazione del danno al DNA4. Questa fosforilazione può essere facilmente identificata utilizzando IF; infatti, il saggio ɣ-H2AX è stato comunemente impiegato per confermare l’induzione di un DSB 5,6,7,8,9. Un aumento del danno al DNA è stato associato alla sensibilità al platino e all’efficacia degli agenti dannosi per il DNA 10,11,12 e ɣ-H2AX è stato proposto come biomarcatore associato alla risposta alla chemioterapia in altri trattamenti antitumorali 13. Su un DSB, una cellula esperta in HRR esegue una serie di eventi che portano BRCA1 e BRCA2 a reclutare RAD51 per sostituire la proteina di replicazione A (RPA) e legarsi al DNA. La riparazione HRR utilizza un modello di DNA per riparare fedelmente il DSB. Tuttavia, quando i tumori sono carenti di HRR, si basano su percorsi di riparazione alternativi come l’unione finale non omologa (NHEJ). NHEJ è noto per essere soggetto a errori e crea un elevato carico mutazionale sulla cellula, che utilizza 53BP1 come regolatore positivo14. Queste proteine danneggiano il DNA possono essere accuratamente identificate come focolai usando IF. Oltre alla colorazione per le proteine, l’IF può essere utilizzato per studiare la protezione della forcella e la formazione di gap di DNA a singolo filamento. La capacità di avere forcelle stabili è stata correlata con la risposta al platino e, recentemente, i saggi gap hanno mostrato il potenziale per prevedere la risposta agli inibitori PARP 6,15,16,17. Pertanto, la colorazione per gli analoghi nucleotidici dopo l’introduzione nel genoma è un altro modo per studiare il DDR.

Ad oggi, la valutazione della DDR nel carcinoma ovarico è stata in gran parte limitata a linee cellulari 2D omogenee che non ricapitolano l’eterogeneità clonale, il microambiente o l’architettura dei tumori in vivo 18,19. Recenti ricerche suggeriscono che gli organoidi sono superiori alle linee cellulari 2D nello studio di processi biologici complessi come i meccanismi DDR6. La presente metodologia valuta RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA e geminina nelle DOP. Questi metodi valutano l’organoide intatto e consentono lo studio dei meccanismi DDR in un contesto più simile al microambiente tumorale in vivo. Insieme alla microscopia confocale e al conteggio automatico dei fuochi, questa metodologia può aiutare a comprendere il percorso DDR nel cancro ovarico e personalizzare i piani di trattamento per le pazienti.

Protocol

Il tessuto tumorale e l’ascite sono stati ottenuti dopo aver ottenuto il consenso del paziente come parte di un biorepository di oncologia ginecologica approvato dal Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Le pazienti sono state incluse se avevano un carcinoma ovarico sieroso di alto grado in stadio avanzato (HGSOC). Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente sul banco, se non diversamente specificato. Tutti i reagenti sono stati preparati a temperatura ambiente (salvo dive…

Representative Results

Il protocollo presentato può colorare, visualizzare e quantificare con successo le proteine di riparazione del danno al DNA nucleare negli organoidi. Questa tecnica è stata utilizzata per colorare e valutare le DOP sia prima che dopo l’irradiazione. Le PDO sono state esposte a 10 Gy di radiazioni e valutate per i seguenti biomarcatori: ɣ-H2AX (Figura 1), un marker di danno al DNA; RAD51 (Figura 2), un indicatore per HRR; 53BP1, un marcatore di NHEJ; RPA, un m…

Discussion

La risposta al danno del DNA svolge un ruolo fondamentale sia nello sviluppo del cancro ovarico che nella resistenza alla chemioterapia. Pertanto, una conoscenza approfondita dei meccanismi di riparazione del DNA è imperativa. Qui viene presentata una metodologia per studiare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi intatti 3D. Viene sviluppato un protocollo riproducibile e affidabile che utilizza anticorpi caratteristici per valutare il danno al DNA, la ricombinazione omologa, l’unione finale non omolog…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati per la guida di Pavel Lobachevsky, PhD nello stabilire questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare la School of Medicine della Washington University nel Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia di St. Louis e la Divisione di Oncologia Ginecologica, il Dean’s Scholar Program della Washington University, la Gynecologic Oncology Group Foundation e il Reproductive Scientist Development Program per il loro sostegno a questo progetto.

Materials

1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) Sigma 14-040-133
1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) Fisher Scientific  ICN1860454
Ant-53BP1 Antibody  BD Biosciences 612522 diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-Geminin Antibody  Abcam ab104306 diluted to 1:200 in staining buffer
Anti-Geminin Antibody  ProteinTech 10802-1-AP diluted to 1:400 in staining buffer
Anti-RAD51 Antibody  Abcam ab133534 diluted to 1:1000 in staining buffer
Anti-yH2AX Antibody  Millipore-Sigma 05-636 diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody Bethyl Laboratories  A300-245A-M diluted to 1:200 in staining buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific  BP1605 100
Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge Thermo Scientific  75004240
Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 Leica  389584
Conical Tubes, 15 mL Corning  14-959-53A
Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)  Thermo Scientific  AMQAF2000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Scientific  C10228
Cover Slip LA Colors Any clear nail polish will suffice
Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2  R&D Systems  3533-010-02 Could probably use Matrigel or other BME Matrix 
DAPI  Thermo Scientific   R37606 NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS 
Glycine  Fisher Scientific  NC0756056
JCountPro JCountPro For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com 
Microcentrifuge Tubes  Fisher Scientific  07-000-243
Nail Polish  StatLab SL102450
Parafomraldehyde (PFA), 2%  Electron Microscopy Sciences  157-4 Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA
Permeabilization Buffer Made in Lab 0.2% X-100 Triton in PBS++ 
Pipette Rainin 17014382
Pipette Tips  Rainin  17014967
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Scientific   P36930
Staining Buffer  Made in Lab 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ 
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System  Thermo Scientific  12-565-8
Triton X-100 Sigma-Alderich  11332481001
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Scientific  15250061
TrypLE Express Invitrogen 12604013 animal origin-free, recombinant enzyme
X-RAD 320 Biological Irradiator  Precision X-Ray Irradiation  X-RAD320

References

  1. Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
  2. Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
  3. Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
  4. Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
  5. Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
  6. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  7. Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
  8. Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
  9. Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
  10. Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
  11. Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
  12. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
  13. Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
  14. Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
  15. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  16. Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
  17. Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
  18. Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
  19. Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
  20. Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
  21. Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
  22. Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
  23. van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
  24. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  25. O’Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
  26. Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
  27. Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
  28. Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
  29. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  30. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  31. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  32. Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).

Play Video

Cite This Article
van Biljon, L., Fashemi, B., Rodriguez, J., Graham, O., Compadre, A., Fuh, K., Khabele, D., Mullen, M. Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays. J. Vis. Exp. (192), e64881, doi:10.3791/64881 (2023).

View Video