Visualizzazione delle proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi del cancro ovarico derivati dal paziente tramite saggi di immunofluorescenza
Summary
Il presente protocollo descrive i metodi per valutare le proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Qui sono inclusi metodi completi di placcatura e colorazione, nonché procedure di quantificazione dettagliate e oggettive.
Abstract
L’immunofluorescenza è una delle tecniche più utilizzate per visualizzare antigeni bersaglio con elevata sensibilità e specificità, consentendo l’identificazione accurata e la localizzazione di proteine, glicani e piccole molecole. Mentre questa tecnica è ben consolidata nella coltura cellulare bidimensionale (2D), si sa meno del suo uso in modelli cellulari tridimensionali (3D). Gli organoidi del cancro ovarico sono modelli tumorali 3D che ricapitolano l’eterogeneità clonale delle cellule tumorali, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Pertanto, sono superiori alle linee cellulari per la valutazione della sensibilità ai farmaci e dei biomarcatori funzionali. Pertanto, la capacità di utilizzare l’immunofluorescenza sugli organoidi del cancro ovarico primario è estremamente utile per comprendere la biologia di questo cancro. L’attuale studio descrive la tecnica di immunofluorescenza per rilevare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi di cancro ovarico (PDO) sierosi di alto grado derivati da pazienti. Dopo aver esposto le DOP a radiazioni ionizzanti, l’immunofluorescenza viene eseguita su organoidi intatti per valutare le proteine nucleari come focolai. Le immagini vengono raccolte utilizzando l’imaging z-stack al microscopio confocale e analizzate utilizzando un software di conteggio automatico dei fuochi. I metodi descritti consentono l’analisi del reclutamento temporale e speciale di proteine di riparazione del danno al DNA e la colocalizzazione di queste proteine con marcatori del ciclo cellulare.
Introduction
Il cancro ovarico è la principale causa di morte a causa di tumori maligni ginecologici. La maggior parte dei pazienti è trattata con farmaci dannosi per il DNA come il carboplatino, e quelli con tumori con deficit di riparazione della ricombinazione omologa (HRR) possono ricevere inibitori della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) 1,2. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti sviluppa resistenza a queste terapie e muore entro 5 anni dalla diagnosi. La disregolazione della risposta al danno del DNA (DDR) è stata associata allo sviluppo del cancro ovarico e alla chemioterapia e alla resistenza agli inibitori di PARP3. Pertanto, lo studio della DDR è fondamentale per comprendere la fisiopatologia del cancro ovarico, i potenziali biomarcatori e le nuove terapie mirate.
Gli attuali metodi per valutare il DDR utilizzano l’immunofluorescenza (IF), in quanto ciò consente l’identificazione accurata e la localizzazione delle proteine danneggiate dal DNA e degli analoghi nucleotidici. Una volta che c’è una rottura a doppio filamento (DSB) nel DNA, la proteina istonica H2AX viene rapidamente fosforilata, formando un punto focale in cui si riuniscono le proteine di riparazione del danno al DNA4. Questa fosforilazione può essere facilmente identificata utilizzando IF; infatti, il saggio ɣ-H2AX è stato comunemente impiegato per confermare l’induzione di un DSB 5,6,7,8,9. Un aumento del danno al DNA è stato associato alla sensibilità al platino e all’efficacia degli agenti dannosi per il DNA 10,11,12 e ɣ-H2AX è stato proposto come biomarcatore associato alla risposta alla chemioterapia in altri trattamenti antitumorali 13. Su un DSB, una cellula esperta in HRR esegue una serie di eventi che portano BRCA1 e BRCA2 a reclutare RAD51 per sostituire la proteina di replicazione A (RPA) e legarsi al DNA. La riparazione HRR utilizza un modello di DNA per riparare fedelmente il DSB. Tuttavia, quando i tumori sono carenti di HRR, si basano su percorsi di riparazione alternativi come l’unione finale non omologa (NHEJ). NHEJ è noto per essere soggetto a errori e crea un elevato carico mutazionale sulla cellula, che utilizza 53BP1 come regolatore positivo14. Queste proteine danneggiano il DNA possono essere accuratamente identificate come focolai usando IF. Oltre alla colorazione per le proteine, l’IF può essere utilizzato per studiare la protezione della forcella e la formazione di gap di DNA a singolo filamento. La capacità di avere forcelle stabili è stata correlata con la risposta al platino e, recentemente, i saggi gap hanno mostrato il potenziale per prevedere la risposta agli inibitori PARP 6,15,16,17. Pertanto, la colorazione per gli analoghi nucleotidici dopo l’introduzione nel genoma è un altro modo per studiare il DDR.
Ad oggi, la valutazione della DDR nel carcinoma ovarico è stata in gran parte limitata a linee cellulari 2D omogenee che non ricapitolano l’eterogeneità clonale, il microambiente o l’architettura dei tumori in vivo 18,19. Recenti ricerche suggeriscono che gli organoidi sono superiori alle linee cellulari 2D nello studio di processi biologici complessi come i meccanismi DDR6. La presente metodologia valuta RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA e geminina nelle DOP. Questi metodi valutano l’organoide intatto e consentono lo studio dei meccanismi DDR in un contesto più simile al microambiente tumorale in vivo. Insieme alla microscopia confocale e al conteggio automatico dei fuochi, questa metodologia può aiutare a comprendere il percorso DDR nel cancro ovarico e personalizzare i piani di trattamento per le pazienti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La risposta al danno del DNA svolge un ruolo fondamentale sia nello sviluppo del cancro ovarico che nella resistenza alla chemioterapia. Pertanto, una conoscenza approfondita dei meccanismi di riparazione del DNA è imperativa. Qui viene presentata una metodologia per studiare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi intatti 3D. Viene sviluppato un protocollo riproducibile e affidabile che utilizza anticorpi caratteristici per valutare il danno al DNA, la ricombinazione omologa, l’unione finale non omolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per la guida di Pavel Lobachevsky, PhD nello stabilire questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare la School of Medicine della Washington University nel Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia di St. Louis e la Divisione di Oncologia Ginecologica, il Dean’s Scholar Program della Washington University, la Gynecologic Oncology Group Foundation e il Reproductive Scientist Development Program per il loro sostegno a questo progetto.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
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