Summary

免疫蛍光アッセイ による 患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)

Published: February 24, 2023
doi:

Summary

本プロトコルは、患者由来卵巣癌オルガノイドにおけるDNA損傷修復タンパク質を評価するための方法を記載する。ここには、包括的なめっきおよび染色方法、および詳細で客観的な定量手順が含まれています。

Abstract

免疫蛍光法は、標的抗原を高い感度と特異性で可視化するために最も広く使用されている技術の1つであり、タンパク質、糖鎖、および低分子の正確な同定と局在を可能にします。この技術は2次元(2D)細胞培養では十分に確立されていますが、3次元(3D)細胞モデルでの使用についてはあまり知られていません。卵巣がんオルガノイドは、腫瘍細胞のクローン不均一性、腫瘍微小環境、細胞間および細胞マトリックス相互作用を再現する3D腫瘍モデルです。したがって、それらは、薬剤感受性および機能的バイオマーカーの評価において細胞株よりも優れている。したがって、原発性卵巣癌オルガノイドで免疫蛍光を利用する能力は、この癌の生物学を理解する上で非常に有益です。現在の研究では、高悪性度の漿液性患者由来の卵巣癌オルガノイド(PDO)中のDNA損傷修復タンパク質を検出するための免疫蛍光法について説明しています。PDOを電離放射線にさらした後、無傷のオルガノイドに対して免疫蛍光法を行い、核タンパク質を病巣として評価します。画像は、共焦点顕微鏡上のzスタックイメージングを使用して収集され、自動焦点計数ソフトウェアを使用して分析されます。記載された方法は、DNA損傷修復タンパク質の時間的および特別な動員の分析、ならびにこれらのタンパク質と細胞周期マーカーとの共局在を可能にする。

Introduction

卵巣がんは、婦人科の悪性腫瘍による主要な死因です。患者の大多数はカルボプラチンなどのDNA損傷薬で治療されており、相同組換え修復(HRR)欠損腫瘍の患者には、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)阻害剤を投与することができます1,2。しかし、ほとんどの患者はこれらの治療法に対する耐性を発達させ、診断から5年以内に死亡します。DNA損傷応答(DDR)の調節不全は、卵巣癌の発症、および化学療法とPARP阻害剤耐性の両方に関連しています3。したがって、DDRの研究は、卵巣癌の病態生理学、潜在的なバイオマーカー、および新しい標的療法を理解する上で不可欠です。

DDRを評価する現在の方法は、免疫蛍光(IF)を利用しており、これにより、DNA損傷タンパク質およびヌクレオチド類似体の正確な同定および局在化が可能になる。DNAに二本鎖切断(DSB)があると、ヒストンタンパク質H2AXは急速にリン酸化され、DNA損傷修復タンパク質が集まる焦点を形成します4。このリン酸化は、IFを利用して容易に同定することができる。実際、ɣ-H2AXアッセイは、DSB 5,6,7,8,9の誘導を確認するために一般的に採用されています。DNA損傷の増加は、プラチナ感受性およびDNA損傷剤の有効性と関連しており101112およびɣ-H2AXは、他の癌治療における化学療法応答に関連するバイオマーカーとして提案されている13DSBでは、HRRに堪能な細胞が一連のイベントを実行し、BRCA1およびBRCA2がRAD51をリクルートして複製タンパク質A(RPA)を置き換え、DNAに結合します。HRR修復は、DNAテンプレートを使用してDSBを忠実に修復します。しかし、腫瘍がHRRを欠損している場合、それらは非相同末端結合(NHEJ)などの代替修復経路に依存する。NHEJはエラーを起こしやすいことが知られており、細胞に高い突然変異負荷を生じさせ、53BP1を正の調節因子として使用する14。これらのDNA損傷タンパク質は、いずれもIFを用いて病巣として正確に同定することができる。IFは、タンパク質の染色に加えて、フォーク保護と一本鎖DNAギャップ形成の研究にも使用できます。安定したフォークを有する能力は白金応答と相関しており、そして最近、ギャップアッセイはPARP阻害剤に対する応答を予測する可能性を示している6151617したがって、ゲノムへの導入後のヌクレオチド類似体に対する染色は、DDRを研究する別の方法である。

今日まで、卵巣癌におけるDDRの評価は、in vivo腫瘍のクローン不均一性、微小環境、または構造を再現しない均質な2D細胞株に大きく限定されていました18,19。最近の研究では、DDRメカニズム6などの複雑な生物学的プロセスの研究において、オルガノイドが2D細胞株よりも優れていることが示唆されています。本手法では、PDO中のRAD51、ɣ-H2AX、53BP1、RPA、およびゲミニンを評価します。これらの方法は、インタクトなオルガノイドを評価し、in vivo腫瘍微小環境により類似した環境でのDDRメカニズムの研究を可能にします。共焦点顕微鏡および自動病巣カウントとともに、この方法論は卵巣癌のDDR経路を理解し、患者の治療計画をパーソナライズするのに役立ちます。

Protocol

腫瘍組織および腹水は、セントルイスのワシントン大学治験審査委員会(IRB)によって承認された婦人科腫瘍学バイオリポジトリの一部として患者の同意を得た後に取得されました。進行期の高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の患者を組み入れた。全ての手順は、特に断らない限りベンチ上で室温で行った。すべての試薬は室温で調製し(特に指示がない限り)、4°Cで保存しました。 <p class="jove_title…

Representative Results

提示されたプロトコルは、オルガノイド中の核DNA損傷修復タンパク質を正常に染色、視覚化、および定量することができます。この手法は、照射前と照射後の両方でPDOの染色と評価に使用されました。PDOは10Gyの放射線に被曝し、次のバイオマーカーについて評価されました:DNA損傷のマーカーであるɣ-H2AX(図1)。RAD51(図2)、HRRのマーカー。53BP1、NHEJ?…

Discussion

DNA損傷応答は、卵巣癌の発症と化学療法抵抗性の両方に不可欠な役割を果たします。したがって、DNA修復メカニズムを完全に理解することが不可欠です。ここでは、DNA損傷修復タンパク質を3Dのインタクトオルガノイドで研究するための方法論を紹介します。DNA損傷、相同組換え、非相同末端結合、および複製ストレスを評価するために、ホールマーク抗体を利用して再現性のある信頼性の?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロトコルを確立する際のパベル・ロバチェフスキー博士の指導に感謝しています。また、セントルイスのワシントン大学医学部の産婦人科および婦人科腫瘍学部門、ワシントン大学の学部長の奨学生プログラム、婦人科腫瘍学グループ財団、および生殖科学者開発プログラムにも感謝しますこのプロジェクトを支援してくださったこと。

Materials

1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) Sigma 14-040-133
1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) Fisher Scientific  ICN1860454
Ant-53BP1 Antibody  BD Biosciences 612522 diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-Geminin Antibody  Abcam ab104306 diluted to 1:200 in staining buffer
Anti-Geminin Antibody  ProteinTech 10802-1-AP diluted to 1:400 in staining buffer
Anti-RAD51 Antibody  Abcam ab133534 diluted to 1:1000 in staining buffer
Anti-yH2AX Antibody  Millipore-Sigma 05-636 diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody Bethyl Laboratories  A300-245A-M diluted to 1:200 in staining buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific  BP1605 100
Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge Thermo Scientific  75004240
Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 Leica  389584
Conical Tubes, 15 mL Corning  14-959-53A
Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)  Thermo Scientific  AMQAF2000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Scientific  C10228
Cover Slip LA Colors Any clear nail polish will suffice
Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2  R&D Systems  3533-010-02 Could probably use Matrigel or other BME Matrix 
DAPI  Thermo Scientific   R37606 NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS 
Glycine  Fisher Scientific  NC0756056
JCountPro JCountPro For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com 
Microcentrifuge Tubes  Fisher Scientific  07-000-243
Nail Polish  StatLab SL102450
Parafomraldehyde (PFA), 2%  Electron Microscopy Sciences  157-4 Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA
Permeabilization Buffer Made in Lab 0.2% X-100 Triton in PBS++ 
Pipette Rainin 17014382
Pipette Tips  Rainin  17014967
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Scientific   P36930
Staining Buffer  Made in Lab 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ 
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System  Thermo Scientific  12-565-8
Triton X-100 Sigma-Alderich  11332481001
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Scientific  15250061
TrypLE Express Invitrogen 12604013 animal origin-free, recombinant enzyme
X-RAD 320 Biological Irradiator  Precision X-Ray Irradiation  X-RAD320

References

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van Biljon, L., Fashemi, B., Rodriguez, J., Graham, O., Compadre, A., Fuh, K., Khabele, D., Mullen, M. Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays. J. Vis. Exp. (192), e64881, doi:10.3791/64881 (2023).

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