Även om det är utmanande är isoleringen av lungendotelceller avgörande för studier av lunginflammation. Detta protokoll beskriver ett förfarande för högavkastande isolering av makrovaskulära och mikrovaskulära endotelceller med hög renhet.
Tillgången på celler isolerade från friska och sjuka vävnader och organ utgör ett nyckelelement för personliga medicinska metoder. Även om biobanker kan tillhandahålla en bred samling av primära och odödliga celler för biomedicinsk forskning, täcker dessa inte alla experimentella behov, särskilt de som är relaterade till specifika sjukdomar eller genotyper. Vaskulära endotelceller (EC) är nyckelkomponenter i immuninflammatorisk reaktion och spelar således en central roll i patogenesen av en mängd olika störningar. I synnerhet visar ECs från olika platser olika biokemiska och funktionella egenskaper, vilket gör tillgängligheten av specifika EC-typer (dvs. makrovaskulär, mikrovaskulär, arteriell och venös) avgörande för att utforma tillförlitliga experiment. Här illustreras enkla procedurer för att erhålla högavkastande, praktiskt taget rena humana makrovaskulära och mikrovaskulära endotelceller från lungartären och lungparenkymet i detalj. Denna metod kan lätt reproduceras till en relativt låg kostnad av vilket laboratorium som helst för att uppnå oberoende från kommersiella källor och erhålla EG-fenotyper/genotyper som ännu inte är tillgängliga.
Det vaskulära endotelet leder blodkärlens inre yta. Det spelar nyckelroller för att reglera blodkoagulation, vaskulär ton och immuninflammatoriska svar 1,2,3,4. Även om odling av endotelceller (EC) isolerade från mänskliga prover är avgörande för forskningsändamål, måste det påpekas att ECs från olika blodkärl (artärer, vener, kapillärer) har specifika funktioner. Dessa kan inte helt rekapituleras av humana navelvenendotelceller (HUVEC), som är lättillgängliga och ofta används i studier av vaskulär endotelpatofysiologi 5,6. Till exempel spelar humana lungmikrovaskulära endotelceller (HLMVEC) nyckelroller vid lunginflammation genom att kontrollera leukocytrekrytering och ackumulering 4,7. Således bör en experimentell inställning som syftar till att reproducera lunginflammation med hög trohet inkludera HLMVEC. Å andra sidan kan EC-dysfunktion observeras i flera patologier; därför är ECs från patienten grundläggande för att bygga en tillförlitlig in vitro-modell av sjukdomen. Till exempel har isoleringen av fragment av ECs från lungartären (HPAECs), dissekerade från de explanterade lungorna hos personer som drabbats av cystisk fibros (CF), gjort det möjligt för oss att avslöja mekanismer för endoteldysfunktion i denna sjukdom 8,9.
Således är protokoll som syftar till att optimera isoleringen av ECs från olika källor / organ även i sjukdomstillstånd avgörande för att ge utredare värdefulla forskningsverktyg, särskilt när dessa verktyg inte är kommersiellt tillgängliga. HLMVEC- och HPAEC-isoleringsprotokoll har tidigare rapporterats 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. I samtliga fall resulterade den enzymatiska nedbrytningen av lungproverna i blandade cellpopulationer, som renades med hjälp av ad hoc-selektiva medier och magnetisk pärl- eller cytometrisk cellsortering. Ytterligare optimeringar av dessa protokoll måste ta itu med två huvudfrågor i EG-isolering: (1) cell- och vävnadskontaminering, som bör lösas så snart som möjligt odlingspassager för att minimera EG: s replikativa åldrande20; och (2) det låga utbytet av primära EG-isolat.
Denna studie beskriver ett nytt protokoll för isolering med hög avkastning och hög renhet av HLMVEC och HPAECs. Denna procedur kan lätt tillämpas och ge praktiskt taget rena makrovaskulära och mikrovaskulära ECs i några steg.
De många roller som vaskulära endotelceller spelar i human patofysiologi gör dessa celler till ett oumbärligt verktyg för in vitro patogenetiska och farmakologiska studier. Eftersom ECs från olika vaskulära platser / organ uppvisar speciella egenskaper och funktioner, skulle tillgängligheten av friska och sjuka ECs från det berörda organet vara idealisk för forskningsändamål. Till exempel är HLMVECs viktiga för studier av lunginflammation; Därför kommer en metod för isolering med hög avkastnin…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av medel från det italienska ministeriet för universitet och forskning (ex 60% 2021 och 2022) till R. P. och genom bidrag från den italienska stiftelsen för cystisk fibros (FFC # 23/2014) och från det italienska hälsoministeriet (L548/93) till MR.
0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |