En detaljert protokoll er gitt her for å etablere humane brystorganoider fra pasientavledede brysttumorreseksjoner eller normalt brystvev. Protokollen gir omfattende trinnvise instruksjoner for dyrking, frysing og tining av brystorganoider avledet fra mennesker.
Brystkreft er en kompleks sykdom som har blitt klassifisert i flere forskjellige histologiske og molekylære subtyper. Pasientavledede brysttumororganoider utviklet i vårt laboratorium består av en blanding av flere tumoravledede cellepopulasjoner, og representerer dermed en bedre tilnærming av tumorcellediversitet og miljø enn de etablerte 2D-kreftcellelinjene. Organoider tjener som en ideell in vitro-modell , noe som muliggjør celle-ekstracellulære matriseinteraksjoner, kjent for å spille en viktig rolle i celle-celle-interaksjoner og kreftprogresjon. Pasientavledede organoider har også fordeler i forhold til musemodeller, da de er av menneskelig opprinnelse. Videre har de vist seg å rekapitulere den genomiske, transkriptomiske og metabolske heterogeniteten til pasienttumorer; Dermed er de i stand til å representere tumorkompleksitet så vel som pasientdiversitet. Som et resultat er de klare til å gi mer nøyaktig innsikt i måloppdagelse og validering og legemiddelfølsomhetsanalyser. I denne protokollen gir vi en detaljert demonstrasjon av hvordan pasientavledede brystorganoider etableres fra resekterte brysttumorer (kreftorganoider) eller reduktivt mammoplastikk-avledet brystvev (normale organoider). Dette etterfølges av en omfattende redegjørelse for 3D-organoidkultur, ekspansjon, passasje, frysing, samt tining av pasientavledede brystorganoidkulturer.
Brystkreft (BC) er den hyppigst forekommende maligniteten hos kvinner, med 287 850 nye tilfeller anslått å bli diagnostisert i USA i 20221. Til tross for de siste fremskrittene i tidlig deteksjon med årlige screeninger, målrettede terapier og en bedre forståelse av genetisk predisposisjon, hersker det å være den nest største årsaken til kreftdødsfall hos kvinner i USA, med > 40.000 dødsfall som tilskrives brystkreft årlig1. Brystkreft er for tiden klassifisert i flere subtyper basert på histopatologisk og molekylær evaluering av primærtumor. Bedre subtypestratifisering har forbedret pasientresultatene med subtypespesifikke behandlingsalternativer2. For eksempel har identifiseringen av HER2 som et proto-onkogen3 ført til utviklingen av trastuzumab, noe som har gjort denne svært aggressive subtypen håndterbar hos de fleste pasienter4. Videre forskning på genetikk og transkriptomikk av denne komplekse sykdommen på en pasientspesifikk måte vil hjelpe til med å utvikle og forutsi bedre pasientspesifikke personlige behandlingsregimer 2,5. Pasientavledede organoider (PUD) er en lovende ny modell for å få innsikt i kreft på molekylært nivå, identifisere nye mål eller biomarkører og designe nye behandlingsstrategier 6,7,8.
PUD er flercellede, tredimensjonale (3D) strukturer avledet fra ferske resekterte primære vevsprøver 8,9. De dyrkes tredimensjonalt ved å være innebygd i en hydrogelmatrise, vanligvis sammensatt av en kombinasjon av ekstracellulære matriksproteiner (ECM), og kan derfor brukes til å studere tumorcelle-ECM-interaksjoner. PUD representerer pasientmangfold og rekapitulerer cellulær heterogenitet og genetiske trekk ved svulsten10,11,12. Å være in vitro-modeller, tillater de genetisk manipulering og narkotikaskjermer med høy gjennomstrømning13,14,15. Videre kan PUD plausibelt brukes til å evaluere pasientens legemiddelfølsomhet og behandlingsstrategier parallelt med klinikken og bidra til å forutsi pasientutfall16,17,18. I tillegg til kjemoterapi har visse organoidmodeller også blitt brukt til å undersøke individuelle pasientresponser på kjemostråling 19,20. Gitt den lovende anvendeligheten av PUD for forskning og klinisk bruk, har National Cancer Institute initiert et internasjonalt konsortium, The Human Cancer Models Initiative (HCMI) 21, for å generere og gi disse tumoravledede nye kreftmodellene. Mange av organoidmodellene av ulike krefttyper utviklet gjennom HCMI er tilgjengelige via American Type Culture Collection (ATCC)22.
Normale brystorganoider har vist seg å bestå av forskjellige epitelcellepopulasjoner tilstede i brystkjertelen 11,23 og tjener dermed som gode modeller for å studere grunnleggende biologiske prosesser, for å analysere drivermutasjoner som forårsaker tumorigenese, og for kreftcelle-avstamningsstudier 6,15 . Brysttumororganoidmodeller har blitt brukt til å identifisere nye mål som er oppmuntrende utsikter for å utvikle nye terapier, spesielt for resistente svulster24,25,26. Ved å bruke pasientavledet xenograft (PDX) og matchede PDX-avledede organoide (PDxO) modeller av behandlingsresistente brysttumorer, viste Guillen et al. at organoider er kraftige modeller for presisjonsmedisin, som kan utnyttes til å evaluere legemiddelrespons og direkte terapibeslutninger parallelt28. Videre gir utviklingen av nye samkulturmetoder for dyrking av PUD med forskjellige immunceller27,28,29, fibroblaster 30,31 og mikrober 32,33 en mulighet til å studere virkningen av tumormikromiljøet på kreftprogresjon. Mens mange slike samkulturmetoder etableres aktivt for PUD avledet fra bukspyttkjertel- eller kolorektaltumorer, har lignende etablerte samkulturmetoder for bryst-PUD bare blitt rapportert for naturlige drepeceller34 og fibroblaster35.
Den første biobanken med >100 pasientavledede organoider som representerer forskjellige brystkreftsubtyper ble utviklet av Hans Clevers-gruppen36,37. Som en del av denne innsatsen utviklet Clevers-gruppen også det første komplekse kulturmediet for brystorganoidvekst, som for tiden er mye brukt36. En oppfølgingsstudie ga en omfattende redegjørelse for etablering og kultur av PUD for bryster og pasientavledede organoide xenotransplantater (PDOXs)38. Welm-laboratoriet utviklet en stor samling av BC PDX-modeller og PDxOs som dyrkes i et relativt enklere vekstmedium som inneholder føtalt bovint serum (FBS) og færre vekstfaktorer39,40. Vi har uavhengig utviklet og karakterisert et stort utvalg naive pasientavledede brystkreftorganoidmodeller11, og deltatt i utviklingen av BC PUD-modeller som en del av HCMI initiativ21. Her tar vi sikte på å gi en praktisk veiledning som beskriver metodikken som brukes av oss for å generere pasientavledede brystorganoidmodellsystemer.
Vårt laboratorium har med hell benyttet de ovennevnte protokollene for å etablere organoider fra naive tumorreseksjoner eller skraping. Vi har også benyttet denne protokollen til å utvikle normale organoider fra brystvev oppnådd via reduktive mammoplastikker eller fra kreftpasienters tilstøtende eller distale normale brystvev. Omtrent 30%-40% av de resekterte primære svulstene resulterte i vellykkede langsiktige (>passasje 8) tumororganoidkulturer. De tumororganoide linjene som avtok etter noen få passas…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke medlemmer av Spector-laboratoriet for kritiske diskusjoner gjennom hele arbeidet. Vi takker Norman Sachs og Hans Clevers (Hubrecht Institute, Nederland) for at de i første omgang ga oss deres organoiddyrkingsprotokoll. Vi anerkjenner CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources for tjenester og teknisk ekspertise (NCI 2P3OCA45508). Vi takker Dr. Qing Gao for hjelp med histologisk prøvepreparering. Vi er takknemlige for støtten fra Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) for å gi pasienttumorprøver. Vi setter også pris på innsatsen til Northwell Health Biobanking-teamet for prøveinnsamling, og vi takker pasientene og deres familier for å donere vev til forskning. Denne forskningen ble støttet av CSHL / Northwell Health (DLS), NCI 5P01CA013106-Project 3 (DLS), og Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson og DLS).
15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
37 °C bead bath | |||
37 °C CO2 incubator | |||
50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
Parafilm | transparent film | ||
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |