Summary

Etablering og kultur av pasientavledede brystorganoider

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

En detaljert protokoll er gitt her for å etablere humane brystorganoider fra pasientavledede brysttumorreseksjoner eller normalt brystvev. Protokollen gir omfattende trinnvise instruksjoner for dyrking, frysing og tining av brystorganoider avledet fra mennesker.

Abstract

Brystkreft er en kompleks sykdom som har blitt klassifisert i flere forskjellige histologiske og molekylære subtyper. Pasientavledede brysttumororganoider utviklet i vårt laboratorium består av en blanding av flere tumoravledede cellepopulasjoner, og representerer dermed en bedre tilnærming av tumorcellediversitet og miljø enn de etablerte 2D-kreftcellelinjene. Organoider tjener som en ideell in vitro-modell , noe som muliggjør celle-ekstracellulære matriseinteraksjoner, kjent for å spille en viktig rolle i celle-celle-interaksjoner og kreftprogresjon. Pasientavledede organoider har også fordeler i forhold til musemodeller, da de er av menneskelig opprinnelse. Videre har de vist seg å rekapitulere den genomiske, transkriptomiske og metabolske heterogeniteten til pasienttumorer; Dermed er de i stand til å representere tumorkompleksitet så vel som pasientdiversitet. Som et resultat er de klare til å gi mer nøyaktig innsikt i måloppdagelse og validering og legemiddelfølsomhetsanalyser. I denne protokollen gir vi en detaljert demonstrasjon av hvordan pasientavledede brystorganoider etableres fra resekterte brysttumorer (kreftorganoider) eller reduktivt mammoplastikk-avledet brystvev (normale organoider). Dette etterfølges av en omfattende redegjørelse for 3D-organoidkultur, ekspansjon, passasje, frysing, samt tining av pasientavledede brystorganoidkulturer.

Introduction

Brystkreft (BC) er den hyppigst forekommende maligniteten hos kvinner, med 287 850 nye tilfeller anslått å bli diagnostisert i USA i 20221. Til tross for de siste fremskrittene i tidlig deteksjon med årlige screeninger, målrettede terapier og en bedre forståelse av genetisk predisposisjon, hersker det å være den nest største årsaken til kreftdødsfall hos kvinner i USA, med > 40.000 dødsfall som tilskrives brystkreft årlig1. Brystkreft er for tiden klassifisert i flere subtyper basert på histopatologisk og molekylær evaluering av primærtumor. Bedre subtypestratifisering har forbedret pasientresultatene med subtypespesifikke behandlingsalternativer2. For eksempel har identifiseringen av HER2 som et proto-onkogen3 ført til utviklingen av trastuzumab, noe som har gjort denne svært aggressive subtypen håndterbar hos de fleste pasienter4. Videre forskning på genetikk og transkriptomikk av denne komplekse sykdommen på en pasientspesifikk måte vil hjelpe til med å utvikle og forutsi bedre pasientspesifikke personlige behandlingsregimer 2,5. Pasientavledede organoider (PUD) er en lovende ny modell for å få innsikt i kreft på molekylært nivå, identifisere nye mål eller biomarkører og designe nye behandlingsstrategier 6,7,8.

PUD er flercellede, tredimensjonale (3D) strukturer avledet fra ferske resekterte primære vevsprøver 8,9. De dyrkes tredimensjonalt ved å være innebygd i en hydrogelmatrise, vanligvis sammensatt av en kombinasjon av ekstracellulære matriksproteiner (ECM), og kan derfor brukes til å studere tumorcelle-ECM-interaksjoner. PUD representerer pasientmangfold og rekapitulerer cellulær heterogenitet og genetiske trekk ved svulsten10,11,12. Å være in vitro-modeller, tillater de genetisk manipulering og narkotikaskjermer med høy gjennomstrømning13,14,15. Videre kan PUD plausibelt brukes til å evaluere pasientens legemiddelfølsomhet og behandlingsstrategier parallelt med klinikken og bidra til å forutsi pasientutfall16,17,18. I tillegg til kjemoterapi har visse organoidmodeller også blitt brukt til å undersøke individuelle pasientresponser på kjemostråling 19,20. Gitt den lovende anvendeligheten av PUD for forskning og klinisk bruk, har National Cancer Institute initiert et internasjonalt konsortium, The Human Cancer Models Initiative (HCMI) 21, for å generere og gi disse tumoravledede nye kreftmodellene. Mange av organoidmodellene av ulike krefttyper utviklet gjennom HCMI er tilgjengelige via American Type Culture Collection (ATCC)22.

Normale brystorganoider har vist seg å bestå av forskjellige epitelcellepopulasjoner tilstede i brystkjertelen 11,23 og tjener dermed som gode modeller for å studere grunnleggende biologiske prosesser, for å analysere drivermutasjoner som forårsaker tumorigenese, og for kreftcelle-avstamningsstudier 6,15 . Brysttumororganoidmodeller har blitt brukt til å identifisere nye mål som er oppmuntrende utsikter for å utvikle nye terapier, spesielt for resistente svulster24,25,26. Ved å bruke pasientavledet xenograft (PDX) og matchede PDX-avledede organoide (PDxO) modeller av behandlingsresistente brysttumorer, viste Guillen et al. at organoider er kraftige modeller for presisjonsmedisin, som kan utnyttes til å evaluere legemiddelrespons og direkte terapibeslutninger parallelt28. Videre gir utviklingen av nye samkulturmetoder for dyrking av PUD med forskjellige immunceller27,28,29, fibroblaster 30,31 og mikrober 32,33 en mulighet til å studere virkningen av tumormikromiljøet på kreftprogresjon. Mens mange slike samkulturmetoder etableres aktivt for PUD avledet fra bukspyttkjertel- eller kolorektaltumorer, har lignende etablerte samkulturmetoder for bryst-PUD bare blitt rapportert for naturlige drepeceller34 og fibroblaster35.

Den første biobanken med >100 pasientavledede organoider som representerer forskjellige brystkreftsubtyper ble utviklet av Hans Clevers-gruppen36,37. Som en del av denne innsatsen utviklet Clevers-gruppen også det første komplekse kulturmediet for brystorganoidvekst, som for tiden er mye brukt36. En oppfølgingsstudie ga en omfattende redegjørelse for etablering og kultur av PUD for bryster og pasientavledede organoide xenotransplantater (PDOXs)38. Welm-laboratoriet utviklet en stor samling av BC PDX-modeller og PDxOs som dyrkes i et relativt enklere vekstmedium som inneholder føtalt bovint serum (FBS) og færre vekstfaktorer39,40. Vi har uavhengig utviklet og karakterisert et stort utvalg naive pasientavledede brystkreftorganoidmodeller11, og deltatt i utviklingen av BC PUD-modeller som en del av HCMI initiativ21. Her tar vi sikte på å gi en praktisk veiledning som beskriver metodikken som brukes av oss for å generere pasientavledede brystorganoidmodellsystemer.

Protocol

Tumorreseksjoner fra brystkreftpasienter, sammen med distalt og tilstøtende normalvev, ble innhentet fra Northwell Health i henhold til Institutional Review Board-protokollene IRB-03-012 og IRB 20-0150, og med skriftlig informert samtykke fra pasientene. MERK: Alle prosedyrer nevnt nedenfor ble utført i et BSL2-rom for vevskultur av pattedyr beregnet for pasientprøver etter godkjenning av biosikkerhetskomiteen. Alle prosedyrer skal utføres i henhold til sikkerhetsprotokoller som oppretthol…

Representative Results

Vi har etablert en biobank av pasientavledede brysttumororganoider med ulike subtyper11. I tillegg har vi etablert multiple normale brystorganoidlinjer avledet fra reduktive vevsprøver fra mammoplastikk eller tilstøtende/distalt normalt bryst fra BC-pasienter ved hjelp av tilnærmingen skissert i figur 1. De ulike pasientavledede brysttumororganoidlinjene varierer i morfologi (figur 2) og veksthastighet (<str…

Discussion

Vårt laboratorium har med hell benyttet de ovennevnte protokollene for å etablere organoider fra naive tumorreseksjoner eller skraping. Vi har også benyttet denne protokollen til å utvikle normale organoider fra brystvev oppnådd via reduktive mammoplastikker eller fra kreftpasienters tilstøtende eller distale normale brystvev. Omtrent 30%-40% av de resekterte primære svulstene resulterte i vellykkede langsiktige (>passasje 8) tumororganoidkulturer. De tumororganoide linjene som avtok etter noen få passas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil takke medlemmer av Spector-laboratoriet for kritiske diskusjoner gjennom hele arbeidet. Vi takker Norman Sachs og Hans Clevers (Hubrecht Institute, Nederland) for at de i første omgang ga oss deres organoiddyrkingsprotokoll. Vi anerkjenner CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources for tjenester og teknisk ekspertise (NCI 2P3OCA45508). Vi takker Dr. Qing Gao for hjelp med histologisk prøvepreparering. Vi er takknemlige for støtten fra Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) for å gi pasienttumorprøver. Vi setter også pris på innsatsen til Northwell Health Biobanking-teamet for prøveinnsamling, og vi takker pasientene og deres familier for å donere vev til forskning. Denne forskningen ble støttet av CSHL / Northwell Health (DLS), NCI 5P01CA013106-Project 3 (DLS), og Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson og DLS).

Materials

15 mL conical tubes VWR 525-1068
175 cm2 tissue culture flask VWR (Corning) 29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubes VWR 525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) Millipore Sigma SCGP00525 SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter Nalgene 566-0020
6-well culture plates  Greiner Cellstar 82050-842
75 cm2 tissue culture flask VWR (Corning) 29185-304
96-well opaque plates Corning 353296 For CTG assay
A83-01 Tocris 2939
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
B-27 supplement Life Technologies 12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader Fisher Scientific (Agilent) For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%) Thermo Fisher 15260037
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent Promega G9683 luminescent cell viability assay
Centrifuge  Eppendorf 5804
Collagenase from Clostridium histolyticum Millipore Sigma C5138 Type IV
Cryolabels Amazon DTCR-1000 Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials  Simport Scientific Inc. T311-1
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher AMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvate Thermo Fisher (Gibco) 11995040
Dual Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Gibco 14190-144 DPBS
Epidermal growth factor (hEGF) Peprotech AF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
FGF-10 (human) Peprotech 100-26
FGF-7/KGF (human) Peprotech 100-19
GlutaMax Life Technologies 35050061
HEK293T cells ATCC CRL-3216  For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells R&D Systems 3710-001-01 Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPES Life Technologies 15630-080
Heregulinβ-1 (human) Peprotech 100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing Container Thermo Fisher 5100-0001
Mycoplasma detection kit Lonza LT07-418
N-acetyl-l-cysteine Millipore Sigma A9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes Thermo Fisher 166-0045 
Nicotinamide Millipore Sigma N0636
Noggin (human) Peprotech 120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 Millipore Sigma S7067
Parafilm transparent film
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140122
Plasmid1: pRL-SV40P Addgene 27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash Addgene 12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash Addgene 12456
pluriStrainer 200 µm pluriSelect 43-50200-01
Primocin Invivogen ANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing Medium Thermo Fisher (Gibco) 12648-010 cell freezing medium
Red Blood Cell lysis buffer Millipore Sigma 11814389001
R-spondin conditioned media In-house or commercial from Peprotech 120-38
Scalpel (No.10) Sklar Instruments Jun-10
Shaker (Incu-shaker Mini) Benchmark H1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 Tocris 2939
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Life Technologies 12605028 cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Millipore Sigma 6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) Abmole Bioscience Y-27632
Zeocin Thermo Fisher R25001

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
  3. di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
  4. Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
  5. Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
  6. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  7. Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
  8. Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
  9. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  10. Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
  11. Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  13. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
  14. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  15. Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
  16. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
  18. Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
  19. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  20. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  21. . HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
  22. . Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
  23. Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  24. Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
  25. Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
  26. Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
  27. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  28. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  29. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
  30. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
  31. Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
  32. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  33. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  34. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  35. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
  36. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  37. . HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
  38. Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
  39. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
  40. . PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
  41. Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
  42. Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
  43. Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
  44. Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

Play Video

Cite This Article
Aggarwal, D., Russo, S., Naik, P., Bhatia, S., Spector, D. L. Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids. J. Vis. Exp. (192), e64889, doi:10.3791/64889 (2023).

View Video