Summary

Visualisering av metabolitter identifisert i det romlige metabolomet av tradisjonell kinesisk medisin ved bruk av DESI-MSI

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

I denne studien presenteres en rekke metoder for å forberede DESI-MSI-prøver fra planter, og en prosedyre for DESI-monteringsinstallasjon, MSI-datainnsamling og prosessering er beskrevet i detalj. Denne protokollen kan brukes under flere forhold for å skaffe romlig metabolominformasjon i planter.

Abstract

Den medisinske bruken av tradisjonell kinesisk medisin skyldes hovedsakelig dets sekundære metabolitter. Visualisering av fordelingen av disse metabolittene har blitt et viktig tema i plantevitenskapen. Massespektrometriavbildning kan trekke ut store mengder data og gi romlig fordelingsinformasjon om disse ved å analysere vevsskiver. Med fordelen av høy gjennomstrømning og høyere nøyaktighet, brukes desorpsjonselektrosprayionisering massespektrometriavbildning (DESI-MSI) ofte i biologisk forskning og i studiet av tradisjonell kinesisk medisin. Prosedyrene som brukes i denne undersøkelsen er imidlertid kompliserte og ikke rimelige. I denne studien optimaliserte vi seksjonerings- og DESI-bildebehandlingsprosedyrer og utviklet en mer kostnadseffektiv metode for å identifisere fordelingen av metabolitter og kategorisere disse forbindelsene i plantevev, med et spesielt fokus på tradisjonelle kinesiske medisiner. Studien vil fremme bruken av DESI i metabolittanalyse og standardisering av tradisjonell kinesisk medisin / etnisk medisin for forskningsrelaterte teknologier.

Introduction

Visualisering av metabolittfordeling har blitt et viktig tema i plantevitenskap, spesielt i tradisjonell kinesisk medisin, da det avslører dannelsesprosessen av spesifikke metabolitter i planten. Med henvisning til tradisjonell kinesisk medisin (TCM), gir den informasjon om de aktive komponentene og veileder anvendelsen av plantedeler i farmasøytiske applikasjoner. Normalt oppnås visualisering av metabolitter ved in situ hybridisering, fluorescensmikroskopi eller immunhistokjemi, men antall forbindelser detektert av disse forsøkene formidler begrenset kjemisk informasjon. Kombinert med vevsfarging kan massespektrometriavbildning (MSI) gi store mengder data og gi romlig fordelingsinformasjon av forbindelser ved å skanne og analysere vevsskiver på mikronnivå1. MSI bruker analytter for desorpsjon og ionisering fra prøveoverflaten, etterfulgt av masseanalyse av de resulterende dampfaseioner og anvendelse av bildebehandlingsprogramvare for å integrere informasjonen og plotte et todimensjonalt bilde som registrerer en spesifikk ionoverflod. Denne teknologien kan bestemme både eksogene og endogene molekyler ved å oppdage den karakteristiske fordelingen av legemidler og deres induserte metabolitter i målvev og organer 2,3,4,5.

Ulike bildebehandlingsmodaliteter har blitt utviklet de siste tiårene; De mest fremtredende blant dem er desorpsjonselektrosprayioniseringsbasert MSI (DESI-MSI), matriseassistert laserdesorpsjon/ionisering (MALDI) og sekundær ionmassespektrometri (SIMS)6. DESI-MSI brukes ofte i biologisk forskning på grunn av sin atmosfæriske drift, høye gjennomstrømning og høyere nøyaktighet7. MALDI har blitt brukt til å identifisere et transtyretinfragment som en potensiell nefrotoksisk biomarkør for gentamicin og for å analysere fordelingen av den nevrotoksiske metabolitten 1-metyl-4-fenylpyridinium etter styring av 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin i mushjerner 8,9. MALDI og DESI har blitt brukt til å bestemme sammensetningen av legemiddelinduserte krystalllignende strukturer i nyrene til doserte kaniner; Disse strukturene består hovedsakelig av metabolitter dannet på grunn av demetylering og/eller oksidasjon av legemidlet10. I tillegg har MSI blitt brukt i lokalisering av metabolsk distribusjon av legemiddeltoksisitet i målorganer. Cellene i plantevev varierer imidlertid og er forskjellige fra dyr og krever spesielle seksjoneringsprosedyrer.

I planter, ved hjelp av MALDI imaging, så langt, har fordelingen av forskjellige forbindelser i hvete (Triticum aestivum) stamme, soyabønne (Glycine max), ris (Oryza sativa) frø, Arabidopsis thaliana blomster og røtter, og bygg (Hordeum vulgare) frø blitt analysert 11,12,13,14,15,16,17,18 . Nylige studier har rapportert at DESI-MSI dukker opp i metabolittanalysen av naturlige legemidler og produkter, spesielt i TCM som Ginkgo biloba, Fuzi og Artemisia annua L 19,20,21. I disse studiene er protokollene for fremstilling av plantematerialprøver forskjellige, og noen krever mer komplekst utstyr, som en frysende mikrotom. DESI-MSI har strenge krav til overflateflatheten til den påviste prøven. Ved analyse av organ eller vev av et dyr, blir prøven vanligvis laget ved kryo-seksjonering22. Prosedyren for kryosnitting er imidlertid komplisert og dyrere, og den vanlige metoden for optimal skjæretemperatur (OCT) har et sterkt signal ved avbildning. I tillegg varierer det medisinske vevet i TCM; for eksempel brukes roten til Salvia miltiorrhiza, kjent som Danshen på kinesisk, mens i Zisu (Perilla frutescens) brukes bladet23,24. Derfor er det nødvendig å forbedre prøveprepareringsprosedyrene for å fremme bruken av DESI i metabolittanalyse for TCM.

Som en flerårig urt og en vanlig brukt TCM, ble S. miltiorrhiza opprinnelig registrert i den eldste medisinmonografien, Shennong’s Classic of Materia Medica (kjent som Shennong Bencao Jing på kinesisk). I denne studien optimaliserte vi seksjonerings- og DESI-bildebehandlingsprosedyrer og utviklet en mer kostnadseffektiv metode for å identifisere fordelingen og kategorisere forbindelsene i vev av S. miltiorrhiza. Denne metoden kan også overvinne ulempene forbundet med tørt vev – at de vanligvis lett sprekker under nitrogenblåsingen – og fremmer utviklingen av TCM. Studien vil fremme standardisering av TCM / etnisk medisin for forskningsrelaterte teknologier.

Protocol

1. Forberedelse av prøver Samle rensede røtter og blader fra en 2 år gammel Salvia miltiorrhiza-plante (figur 1A), og skjær direkte i en tverrsnittstykkelse på ca. 3-5 mm for hånd. Deretter fester du prøven på et adhesjonsmikroskopglassglass ved hjelp av dobbeltsidig tape (figur 1B).MERK: Kontroller at størrelsen på dobbeltsidig tape er større enn prøven. Hvis vevet er tørket, suge dem i vann eller 4% paraform…

Representative Results

Denne protokollen kan føre til identifisering og distribusjon av forbindelser i planteprøver. I MS-bildet av en bestemt m / z representerer fargen på hver enkelt piksel den relative intensiteten til m / z, og kan dermed knyttes til den naturlige fordelingen og overflod av metabolittionet gjennom hele prøven. Jo høyere overflod av kjemikaliet ved oppsamlingsposisjonen, desto lysere er fargen. Linjen på bildet (figur 4A-D) viser fargenes gradient. Her va…

Discussion

Fremveksten av MS-teknologi har åpnet en ny innsikt i naturproduktforskning på molekylært nivå de siste årene24. MS-instrumentet, med sin høye følsomhet og høye gjennomstrømning, muliggjør målrettet og ikke-målrettet analyse av metabolitter i naturlige produkter, selv med sporkonsentrasjon25. Derfor er MS for tiden mye brukt innen tradisjonell kinesisk medisin (TCM) kjemi. Den kvalitative og kvantitative forskningen på den kjemiske sammensetningen av TCM kan gi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of Sichuan-provinsen (nr. 2022NSFSC0171) og Xinglin Talent Program ved Chengdu University of TCM (nr. 030058042).

Materials

2-Propanol Fisher CAS:67-63-0 HPLC grade
Acetonitrile Sigma-aldrich Number-75-05-8 LC-MS grade
Adhesion Microscope slides Citotest scientific 80312-3161 Microscope glass slides  can adhere to  the sample 
Air cooled dry vacuum pump EYELA FDU-2110 Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid ACS F1089 | 64-18-6 LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin) Waters 186006013-1 LC-MS grade
Methanol Sigma-aldrich Number-67-56-1 LC-MS grade
Parafilm  Bemis Company sc-200288 Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde Sigma-aldrich V900894 Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source Waters Synapt XS

References

  1. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  2. Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
  3. Qiu, Z. -. D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
  4. Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
  5. Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
  6. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
  7. Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
  8. Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
  9. Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
  10. Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
  11. Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
  12. Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
  13. Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
  14. Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
  15. Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
  16. Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
  17. Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
  18. Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
  19. Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
  20. Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
  21. Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
  22. Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
  23. Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
  24. Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
  25. Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
  26. Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
  27. Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
  28. Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
  29. Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
  30. Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
  31. Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
  32. Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  33. Castaing, R., Slodzian, G. Microanalyse par émission secondaire. Journal of Microscopy. 1, 395-410 (1962).
  34. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  35. Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).

Play Video

Cite This Article
Xu, B., Chen, L., Lv, F., Pan, Y., Fu, X., Pei, Z. Visualization of Metabolites Identified in the Spatial Metabolome of Traditional Chinese Medicine Using DESI-MSI. J. Vis. Exp. (190), e64912, doi:10.3791/64912 (2022).

View Video