Summary

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

Published: April 07, 2023
doi:

Summary

고처리량 scRNA-seq 분석법의 실현 가능성과 효과는 식물 연구에서 단일 세포 시대를 예고합니다. 여기에 제시된 것은 특정 Arabidopsis thaliana 뿌리 세포 유형을 분리하고 후속 전사체 라이브러리 구성 및 분석을 위한 강력하고 완전한 절차입니다.

Abstract

다세포 유기체에서 발달 프로그래밍 및 환경 반응은 다른 세포 유형 또는 세포 내에서도 매우 다양할 수 있으며, 이를 세포 이질성이라고 합니다. 최근 몇 년 동안 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술과 결합된 단일 세포 및 세포 유형 분리는 단일 세포 분해능에서 생물학적 과정을 연구하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 그러나 식물 세포를 분리하는 것은 식물 세포벽의 존재로 인해 상대적으로 더 어려우며, 이는 식물에서 단일 세포 접근법의 적용을 제한합니다. 이 프로토콜은 식물 세포를 사용한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기반 단일 세포 및 세포 유형 분리를 위한 강력한 절차를 설명하며, 이는 다운스트림 다중 오믹스 분석 및 기타 연구에 적합합니다. 애기장 대 뿌리 형광 마커 라인을 사용하여 목부-극 페리사이클 세포, 측면 뿌리 초기 세포, 측면 뿌리 캡 세포, 피질 세포 및 내배엽 세포와 같은 특정 세포 유형이 어떻게 분리되는지 보여줍니다. 또한, Smart-seq2를 이용한 효과적인 다운스트림 전사체 분석 방법도 제공된다. 세포 분리 방법 및 전사체 분석 기술은 다른 세포 유형 및 식물 종에 적용할 수 있으며 식물 과학 분야에서 광범위한 응용 가능성을 가지고 있습니다.

Introduction

세포는 모든 생명체의 기본 단위이며 구조적 및 생리적 기능을 수행합니다. 다세포 유기체의 세포는 명백한 동시성을 나타내지만, 다른 유형과 개별 세포의 세포는 발달 및 환경 반응 동안 전사체에 차이를 나타냅니다. 고처리량 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 세포 이질성을 이해하는 데 있어 전례 없는 성능을 제공합니다. 식물 과학에 scRNA-seq를 적용하면 식물 세포 아틀라스1을 성공적으로 구성하는 데 기여했으며, 식물 조직2에서 희귀 세포 분류군을 식별하는 데 사용되었으며, 식물 조직의 세포 유형 구성에 대한 통찰력을 제공하고, 식물 발달 및 분화 중에 사용되는 세포 정체성 및 중요한 기능을 식별하는 데 사용되었습니다. 또한, 식물 조직(1,2,3)에서 시공간 발달 궤적을 추론하여 새로운 마커 유전자4를발견하고, scRNA-seq를 사용하여 중요한 전사 인자5의 기능을 연구하여다른 식물3에서 동일한 세포 유형의 진화적 보존을 밝힐 수 있다. 비생물적 스트레스는 식물의 성장과 발달에 가장 중요한 환경적 영향 중 하나입니다. 단일 세포 전사체 시퀀싱을 통해 다양한 치료 조건에서 식물 조직의 세포 유형 구성 변화를 탐색함으로써 비생물적 스트레스 반응 메커니즘도 해결할 수 있습니다6.

scRNA 염기서열 분석을 사용하여 세포 유형 간의 전사 이질성을 해결할 수 있는 가능성은 세포 분리 방법 및 염기서열 분석 플랫폼에 따라 다릅니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 광 산란 및 세포의 형광 특성을 기반으로 scRNA-seq를 위해 세포의 하위 집단을 분리하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 형질전환 기술에 의한 형광 마커 라인의 개발은 FACS7에 의한 세포 분리의 효율성을 크게 향상시켰습니다. Smart-seq28을 사용하여 scRNA-seq를 수행하면 세포 이질성을 해부하는 능력이 더욱 향상됩니다. Smart-seq2 분석법은 유전자 검출에 대한 민감도가 우수하며, 낮은 전사체 입력(transcript input)에서도 유전자를 검출할 수 있다 9. 벌크 세포 유형 수집 외에도 최신 세포 분류기는 단일 세포 인덱스 분류 형식을 제공하여 Smart-seq210 또는 CEL-seq211과 같은 기타 다중 RNA-seq 방법을 사용하여 단일 세포 분해능으로 전사체 분석을 가능하게 합니다. 단일 세포 또는 세포 유형 분류는 병렬 다중 오믹스 연구(parallel multi-omics studies)와 같은 다른 많은 다운스트림 응용 분야에 잠재적으로 사용될 수 있습니다12,13. 여기에 제시된 것은 FACS에 의해 애기장대 마커 세포주의 뿌리에서 목부-극 페리사이클 세포, 측면 뿌리 캡 세포, 측면 뿌리 초기 세포, 피질 세포 및 내배엽 세포와 같은 식물 세포 유형을 분리하기 위한 강력하고 다재다능한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 또한 다운스트림 전사체 분석을 위한 Smart-seq2 라이브러리 구성을 포함합니다.

Protocol

다음 프로토콜은 목부-극 페리사이클 세포(J0121), 측근 초기 세포, 외측 뿌리 캡 세포(J3411), 내피 및 피질 세포(J0571)(그림 1A)와 같은 뿌리 세포 유형에 대한 형광 및 형광 마커 라인이 없는 A. thaliana 야생형(WT) 종자에 최적화되었습니다. 이전에 발표된 보고서14에 이어 야생형 애기장대 식물에 GATA23 프로모터 구동 GFP 구축물을 도입함으로써 생성?…

Representative Results

원형질체 분리이 프로토콜은 형광 A. thaliana 루트 마커 라인의 원형질체 분류에 효과적입니다. 이러한 마커 라인은 형광 단백질과 표적 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 유전자를 융합하거나 인핸서 트랩 라인을 사용하여 개발되었습니다(그림 1). 수많은 조직과 기관이 모델 식물과 작물에서 특정 형광 마커를 발현하는 세포 유형으로 해부되었습니?…

Discussion

Smart-seq2 기반 프로토콜은 수백개의 셀(8)로부터 신뢰할 수 있는 시퀀싱 라이브러리를 생성할 수 있다. 출발 물질의 품질은 전사체 분석의 정확성에 필수적입니다. FACS는 관심 세포를 준비하기 위한 강력한 도구이지만, 이 절차, 특히 원형질체 단계는 식물 응용 분야에 최적화되어야 합니다. 레이저 포획 미세해부(LCM) 또는 수동 해부된 세포도 입력(25,26)으로서 사…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 Shanghai Jiao Tong University 농업 및 생물학 학교의 단일 세포 다중 오믹스 시설에서 이 프로토콜을 설정했으며 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 32070608), 상하이 푸장 프로그램(보조금 번호 20PJ1405800) 및 상하이 자오퉁 대학교(보조금 번호 Agri-X20200202, 2019TPB05).

Materials

0.22 µm strainer Sorfa  622110
Agar Yeasen 70101ES76
Agilent fragment analyzer Aglient Aglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kit Aglient DNF-474-0500
Ampure XP beads BECKMAN A63881
Betaine yuanye S18046-100g
Bleach Mr Muscle FnBn83BK 20% (v/v) bleach
BSA sigma 9048-46-8
CaCl2 yuanye S24109-500g
Cellulase R10 Yakult (Japan) 9012-54-8
Cellulase RS Yakult (Japan) 9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL) Eppendolf 30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants Beyotime R0127
dNTPs (10 mM) NEB N0447S
DTT (0.1 M)
invitrogen
18090050
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680
FACS BD FACS Melody BD-65745
FACS Sony SH800S
Filter tip  (1000 µL) Thermo Scientific TF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL) Thermo Scientific TF140-200-Q
Filter tip (10 µL) Thermo Scientific TF104-10-Q
Filter tip (100 µL) Thermo Scientific TF113-100-Q
Fluorescent microscope Nikon Eclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating Mixer Kylin -Bell BE-1100
Hemicellulase sigma 9025-56-3
IS PCR primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) Roche  7958935001
KCl Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 7447-40-7
Macerozyme R10 Yakult (Japan) 9032-75-1
Magnetic separation stand invitrogen 12321D
Mannitol aladdin 69-65-8
MES aladdin 145224948
MgCl2  yuanye R21455-500ml
Microcentrifuges Eppendorf Centrifuge 5425
Micro-mini-centrifuge Titan Timi-10k
MS Phytotech M519
Nextera XT DNA Library Preparation Kit illumina FC-131-1024
oligo-dT30VN primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrument Thermal cycler A24811
Pectolyase Yakult (Japan) 9033-35-6
Plant marker lines Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit invitrogen Q33231
Qubit 2.0 fluorometer invitrogen Q32866
RNase inhibitor  Thermo Scientific EO0382
RNase-free water invitrogen 10977023
Solution A 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestle BIOTREAT 453463
Strainer (40 µm ) Sorfa  251100
Superscript enzyme (200 U/µL) invitrogen 18090050
SuperScript VI buffer (5x) invitrogen 18090050
T0est tube (5 mL) BD Falcon 352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) AXYGEN PCR-05-C
Triton X-100 Sangon Biotech A600198-0500
TSO primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'
Vortex Titan VM-T2

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Cite This Article
Zhang, J., Ahmad, M., Xie, R., Gao, H. Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types. J. Vis. Exp. (194), e64913, doi:10.3791/64913 (2023).

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