본 프로토콜은 인간 및 비인간 영장류 소변 유래 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 분리, 확장 및 재프로그래밍하는 방법과 새로 생성된 iPSC의 피더 없는 유지 관리에 대한 지침을 설명합니다.
영장류 만능 줄기 세포와 그 유도체를 연구하는 종 간 접근법은 질병, 발달 및 진화의 분자 및 세포 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 영장류 유도만능줄기세포(iPSC)에 보다 쉽게 접근할 수 있도록 하기 위해 본 논문에서는 소변 유래 세포에서 인간 및 비인간 영장류 iPSC를 생성하는 비침습적 방법과 피더 프리 배양 방법을 사용한 유지 관리를 제시합니다.
소변은 비멸균 환경(예: 동물의 케이지)에서 샘플링하고 1차 세포 배양 중에 광범위한 항생제 칵테일로 처리하여 오염을 효율적으로 줄일 수 있습니다. 소변 유래 세포의 증식 후, iPSC는 상업적으로 이용 가능한 센다이 바이러스 벡터 시스템의 변형된 형질도입 방법에 의해 생성됩니다. 첫 번째 iPSC 콜로니는 이미 5일 후에 볼 수 있으며 빠르면 10일 후에 채취할 수 있습니다. 효소가 없는 해리 완충액을 사용한 일상적인 덩어리 계대배양은 50개 이상의 계대에 대해 생성된 iPSC의 다능성을 지원합니다.
인간과 비인간 영장류(NHP)의 게놈 비교는 우리의 진화 역사와 인간 특이적 형질의 진화를 이해하는 데 중요합니다1. 추가적으로, 이러한 비교는 보존된 DNA 서열2을 식별함으로써, 예를 들어, 질병 관련 변이체3의 우선순위를 정함으로써 기능의 추론을 가능하게한다. 유전자 발현 수준과 같은 분자 표현형의 비교는 게놈 비교를 더 잘 해석하고 예를 들어 세포 표현형 차이를 발견하는 데 중요합니다. 또한, DNA 수준에서의 비교와 유사하게 기능적 관련성을 추론할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 따라서 인간 내에서 의학적으로 관련된 변이를 더 잘 해석할 수 있다4. 이러한 비교 연구에 포괄적인 분자 표현형 데이터를 통합하려면 적절한 생물학적 자원(즉, 종 전반에 걸친 상동 세포)이 필요합니다. 그러나 윤리적이고 실용적인 이유로 인해 특히 개발 중에 이러한 유사한 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능합니다. 유도만능줄기세포(iPSCs)는 시험관 내에서 접근하기 어려운 세포 유형의 생성을 가능하게 하고5,6, 실험적으로 접근가능하며, 영장류 비교에 사용되어 왔다6,7,8,9,10,11,12,13,14.
iPSC를 생성하려면 다시 프로그래밍할 1차 셀을 획득해야 합니다. 소변에서 분리된 세포는 영장류로부터 비침습적으로 샘플링할 수 있고, 줄기세포와 유사한 분자 프로파일로 인해 쉽게 재프로그래밍할 수 있다는 장점이 있다15. 영장류 iPSC를 유지하기 위한 배양 조건은 재프로그래밍만큼 중요합니다. 일반적으로 인간 만능 줄기 세포의 배양에는 필수 영양소와 배아 줄기 세포(ESC)를 위한 스캐폴드를 제공하는 정의되지 않은 혈청 기반 배지와 마우스 배아 섬유아세포(소위 영양세포)의 공동 배양이 필요했습니다16. 화학적으로 정의되고 피더가 없는 배양 시스템(17,18)의 개발 이후, 현재 상업적으로 이용 가능한 iPSC 배양 배지 및 매트릭스의 다양한 옵션이 있습니다. 그러나 이러한 배양 조건의 대부분은 인간 ESC 및 iPSC에 최적화되어 있으므로 NHP iPSC 배양에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는 소변 세포 배양에서 파생된 인간 및 NHP iPSC를 생성하고 유지하기 위한 지침을 제공합니다.
2006년 섬유아세포에서 정의된 인자의 강제 발현에 의한 iPSC 생성이 처음 보고된 이후, 이 방법은 다양한 기원의 다양한 세포 유형에 적용되었습니다 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. 그 중에서도 소변 유래 세포만 완전히 비침습적으로 얻을 수 있습니다. 앞서 기술한 Zhou et al.33의 프로토콜에 따르면, 광범위한 항생제를 보충함으로써 비멸균 샘플에서도 영장류의 소변에서 세포를 분리하고 확장할 수 있다15. 특히, 이 프로토콜에 의해 샘플링된 소변 유래 세포는 섬유아세포의 기존 재프로그래밍(20-30일, 우리의 경험에서)보다 더 짧은 기간(콜로니가 5-15일 후에 볼 수 있음) 내에 iPSC를 생성할 수 있는 높은 잠재력을 나타내며 충분히 높은 성공률로 나타납니다. 이러한 소변 유래 세포는 중간엽 줄기세포 유사 세포와 방광 상피 세포의 혼합 집단으로 분류되어 높은 재프로그래밍 효율을 일으켰다(15).
1차 셀의 변화 외에도 iPSC를 생성하는 재프로그래밍 방법도 사용 목적에 따라 다릅니다. 인간 체세포에 대한 종래의 재프로그래밍 절차는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 이용한 재프로그래밍 인자의 과발현에 의해 수행되었으며, 이는 게놈 5,34,35에서 외인성 DNA의 통합을 허용하였다. 생성된 iPSC를 게놈적으로 온전하게 유지하기 위해 연구자들은 절제 가능한 PiggyBac 벡터 36,37, 에피솜 벡터38,39, 센다이 바이러스 40 및 아데노바이러스 41과 같은 비통합 바이러스 벡터, mRNA 형질감염 42, 단백질 형질감염 43,44 및 화학 화합물 처리 45. 효율성과 취급 용이성으로 인해 센다이 바이러스 기반 재프로그래밍 벡터가 이 프로토콜에 사용됩니다. 일차 세포의 감염은 플레이팅 전에 5의 감염 다중도(MOI)에서 세포 및 바이러스의 1시간 현탁 배양에서 수행됩니다. 이 변형된 단계는 바이러스가 부착된 세포 배양물에 직접 첨가되는 종래의 방법에 비해 세포 표면과 바이러스 사이의 접촉 가능성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 더 많은 iPSC 콜로니를 생성할 수 있다15.
인간 및 NHP 만능 줄기 세포의 계대는 덩어리 계대증 및 단세포 계대증에 의해 수행될 수 있습니다. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 칼슘과 마그네슘 이온을 결합하여 카데린과 인테그린의 부착 활성을 방지하는 비용 효율적인 킬레이트제입니다. EDTA는 또한 미분화 세포가 다른 접착 분자로 인해 분화 된 세포보다 먼저 분리되기 때문에 온화하고 선택적인 해리 시약으로 사용됩니다. 완전한 해리는 단백질 키나아제(Rho/Rock) 매개 미오신 과활성화를 포함하는 Rho/Rho 관련 코일 코일을 통해 영장류 iPSC의 대규모 세포 사멸을 유도합니다. 따라서 배양 배지에 Rho/Rock 억제제를 보충하는 것은 현탁액46,47의 단일 세포가 필요한 실험에 필수적입니다. 이 프로토콜에서는 일상적인 패시징 방법으로 덩어리 패시징을 권장하고 정의된 셀 번호의 시딩이 필요한 경우 또는 하위 클로닝 중에 필요한 경우에만 단일 셀 패시징을 권장합니다.
iPSC는 시험관 내에서 접근할 수 없는 세포 유형을 생성할 수 있기 때문에 가치 있는 세포 유형입니다. 재프로그래밍을 위한 출발 물질로서, 예를 들어, 섬유아세포는 모든 영장류 종에서 쉽게 구할 수 있는 것은 아니지만, 이 논문은 소변 유래 세포에서 iPSC를 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 세포는 배양 배지에 광범위한 항생제를 보충하여 비멸균 영장류 소변 샘플에서도 비?…
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 DFG EN 1093/5-1(프로젝트 번호 458247426)의 지원을 받았습니다. M.O.는 JSPS Overseas Research Fellowship의 지원을 받았습니다. 모든 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 유세포 분석은 뮌헨 생물 의학 센터의 핵심 시설 유세포 분석의 도움으로 수행되었습니다. 비디오 촬영을 지원해 주신 교토 대학 ASHBi의 Makoto Shida와 Tomoyo Muto에게 감사드립니다.
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |