Summary

Mätning av näthinnans kärldiameter från musfluorescerande angiografibilder

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Näthinnevaskulatur hos möss är särskilt intressant för att förstå mekanismerna för bildandet av kärlmönster. Detta protokoll mäter automatiskt diametern på retinala kärl hos möss från fluorescerande angiografi fundusbilder på ett fast avstånd från den optiska skivan.

Abstract

Det är viktigt att studera utvecklingen av retinala kärl vid retinopatier där onormal kärltillväxt i slutändan kan leda till synförlust. Mutationer i genen för mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor (Mitf) visar hypopigmentering, mikroftalmi, näthinnedegeneration och i vissa fall blindhet. In vivo-avbildning av musens näthinna med icke-invasiva metoder är avgörande för ögonforskning. Men med tanke på dess lilla storlek är avbildning av musfundus svår och kan kräva specialverktyg, underhåll och utbildning. I denna studie har vi utvecklat en unik mjukvara som möjliggör analys av näthinnans kärldiameter hos möss med ett automatiserat program skrivet i MATLAB. Ögonbottenfotografier erhölls med ett kommersiellt funduskamerasystem efter en intraperitoneal injektion av en fluoresceinsaltlösning. Bilderna ändrades för att förbättra kontrasten, och MATLAB-programmet gjorde det möjligt att extrahera den genomsnittliga kärldiametern automatiskt på ett fördefinierat avstånd från den optiska skivan. De vaskulära förändringarna undersöktes hos vildtypsmöss och möss med olika mutationer i Mitf-genen genom att analysera näthinnans kärldiameter. Det specialskrivna MATLAB-programmet som utvecklats här är praktiskt, lätt att använda och gör det möjligt för forskare att analysera medeldiametern och den genomsnittliga totala diametern, samt antalet kärl från musens retinala kärl, bekvämt och tillförlitligt.

Introduction

Den kanske mest undersökta kärlbädden i kroppen är näthinnans vaskulatur. Med ständigt förbättrad teknisk sofistikering är näthinnevaskulatur lätt att fotografera hos levande patienter och används inom många forskningsområden1. Dessutom har musens retinala kärl under utvecklingen visat sig vara ett mycket effektivt modellsystem för forskning om den grundläggande biologin bakom vaskulär tillväxt. Det primära syftet med näthinnans kärl är att förse den inre delen av näthinnan med metaboliskt stöd genom ett laminärt kapillärnät som genomsyrar nervvävnaden2. Icke desto mindre kan näthinnans tillstånd, och följaktligen eventuell dysfunktion eller atrofi, ha betydande effekter på både förgreningarna av näthinnans kärl och artärernas diameter, vilket visar på ett samspel mellan näthinnecellerna och kärlen 3,4. Det är känt att många ögonsjukdomar, inklusive retinopati hos prematuritet (ROP), diabetisk retinopati (DR), åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), glaukom och kärlnybildning på hornhinnan, kan resultera i onormal okulär angiogenes5. När det gäller den retinala vaskulaturen uppvisar musmodeller av näthinnedegeneration ofta förändringar som är jämförbara med de som ses vid mänskliga kärlsjukdomar 6,7. Myc-supergenfamiljen av fundamentala helix-loop-helix-zipper-transkriptionsfaktorer inkluderar genen för mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor (Mitf) som uttrycks i retinalt pigmentepitel (RPE)8,9,10.

Många organ, inklusive ögat, örat, immunsystemet, centrala nervsystemet, njure, ben och hud, har visat sig regleras av Mitf 9,11,12,13. Vi har upptäckt att RPE:s struktur och funktion påverkas hos möss som bär på olika mutationer i Mitf-genen, vilket resulterar i vissa fall av näthinnedegeneration och slutligen synförlust10. Nyligen har det visat sig att antalet kärl och kärldiametern skiljer sig signifikant mellan Mitf-mutanta och vildtypsmöss14. Forskare och läkare kan nu exakt kvantifiera näthinnans kärl in vivo tack vare utvecklingen av näthinneavbildning. Sedan 1800-talet har forskare och läkare utnyttjat fördelen med att visualisera den retinala kärlen, och fluoresceinangiografi (FA) har visat både retinalt blodflöde och nedbrytning av blod-näthinnebarriären15.

Den här artikeln visar hur man analyserar näthinnans kärldiameter från musens FA-bilder med en specialskriven kod i MATLAB-programvaran.

Protocol

Alla experiment godkändes av den isländska livsmedels- och veterinärmyndigheten (MAST-licens nr 2108002). Alla djurstudier genomfördes i enlighet med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Han- och honmöss av C57BL/6J och Mitfmi-vga9/+ användes i denna studie. C57BL/6J-möss (n = 7) användes som kontroll. De vilda typerna erhölls kommersiellt (se Materialtabell), men alla muterade möss (n…

Representative Results

Figur 1 visar den process som används för att analysera näthinnans kärl, som tillämpas på FFA-bilder från möss från alla testade möss. En radie som är dubbelt så stor som den optiska skivan används för att mäta pixlarnas intensitet i en cirkulär, medurs riktning från den optiska skivans centrum. Den markerar pixlar med en start- eller slutpunkt när den stöter på punkter över respektive under ett användarspecificerat tröskelvärde. Detta upprepas 30 gånger, varje gång…

Discussion

Den här artikeln är den första som presenterar en metod för att analysera näthinnans kärldiameter och retinala vaskulatur från musbilder. Eftersom endast fundusavbildning användes för att ta bilder av näthinnans kärl har metoden flera nackdelar, varav en är att man endast kan sluta sig till förändringar i de ytliga lagren av den retinala kärlen hos de möss som undersöktes i denna studie; Eventuella skillnader i de djupare lagren är ännu okända.

En unik bildanalysmetod för…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av ett postdoktoralt stipendium från den isländska forskningsfonden (217796-052) (A.G.L.) och Helga Jónsdóttir och Sigurlidi Kristjánsson minnesfond (A.G.L och T.E.). Författarna tackar Prof. Eiríkur Steingrímsson för att ha tillhandahållit mössen.

Materials

1% Tropicamide (Mydriacyl) Alcon Inc Laboratories Mydriatic agent
2% Methocel OmniVision Eye Care Hydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6J Jackson Laboratory 000664 Wild type mice
Chanazine 2% (xylazine) Chanelle Animal Health UK BN I21322/I Anesthesia IP
Excel for Microsoft 365 Microsoft Inc Software package
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich 28803-100G Fluorescent angiography
Matlab 8.0 The MathWorks, Inc. Software package
Micron IV rodent fundus camera Phoenix-Micron 40-2200 Fundus photography
Phenylephrine 10% w/v Bausch & Lomb Mydriatic agent
Phosphate Buffered Saline – 100 tablets Gibco 18912-014 Dilution
Sigmaplot 13 Jandel Scientific Software Software package
S-Ketamine, 25 mg/mL Pfizer Inc. PAA104470 Anesthesia IP

References

  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Ma, Y., et al. Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).
  4. Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa. Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).
  5. Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411 (2012).
  6. Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).
  7. Liu, H., et al. Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).
  8. Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network. Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).
  9. Arnheiter, H. The discovery of the microphthalmia locus and its gene. Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).
  10. Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function. Scientific Reports. 9 (1), 15386 (2019).
  11. Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF. Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).
  12. Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).
  13. Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis. Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).
  14. Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature. Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).
  15. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).
  16. Wei, W., et al. Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography. Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248 (2020).
  17. Salas, M., et al. Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).
  18. Albanna, W., et al. Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis. PLoS One. 13 (10), e0204689 (2018).
  19. Moult, E. M., et al. Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye. Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005 (2017).

Play Video

Cite This Article
García-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. Measuring Retinal Vessel Diameter from Mouse Fluorescent Angiography Images. J. Vis. Exp. (195), e64964, doi:10.3791/64964 (2023).

View Video