Denne protokollen beskriver hvordan man bruker TIRF-mikroskopi til å spore individuelle ionekanaler og bestemme deres aktivitet i støttede lipidmembraner, og derved definere samspillet mellom lateral membranbevegelse og kanalfunksjon. Den beskriver hvordan du klargjør membranene, registrerer dataene og analyserer resultatene.
Høyoppløselige bildebehandlingsteknikker har vist at mange ionkanaler ikke er statiske, men underlagt svært dynamiske prosesser, inkludert forbigående forening av poredannende og hjelpeunderenheter, lateral diffussjon og klynging med andre proteiner. Forholdet mellom lateral diffusjon og funksjon er imidlertid dårlig forstått. For å nærme oss dette problemet beskriver vi hvordan lateral mobilitet og aktivitet av individuelle kanaler i støttede lipidmembraner kan overvåkes og korreleres ved hjelp av total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Membraner fremstilles på et ultratynt hydrogelsubstrat ved hjelp av DIB-teknikken (Droplet Interface Bilayer). Sammenlignet med andre typer modellmembraner har disse membranene fordelen av å være mekanisk robuste og egnet for svært følsomme analytiske teknikker. Denne protokollen måler Ca 2+ ionfluks gjennom enkeltkanaler ved å observere fluorescensutslipp av et Ca2+-følsomt fargestoff i nærheten av membranen. I motsetning til klassiske enkeltmolekylære sporingsmetoder, er det ikke nødvendig med fluorescerende fusjonsproteiner eller etiketter, som kan forstyrre lateral bevegelse og funksjon i membranen. Mulige endringer i ioneflux assosiert med konformasjonsendringer av proteinet skyldes bare proteinlateral bevegelse i membranen. Representative resultater er vist ved bruk av mitokondrieproteintranslokasjonskanalen TOM-CC og bakteriekanalen OmpF. I motsetning til OmpF er gating av TOM-CC svært følsom for molekylær innesperring og arten av lateral diffusjon. Derfor er støttede dråpegrensesnitt dobbeltlag et kraftig verktøy for å karakterisere koblingen mellom lateral diffusjon og funksjonen til ionkanaler.
Denne protokollen tar sikte på å beskrive hvordan man studerer korrelasjonen mellom membranmobilitet og ionekanalpermeabilitet av membranproteiner i polymerstøttede dråpegrensesnitt dobbeltlag (DIB) membraner 1,2,3.
Den nåværende teknikken utfyller et imponerende utvalg av avanserte optiske og overflateanalytiske verktøy, for eksempel enkeltpartikkelsporing4,5, fluorescenskorrelasjonsspektroskopi6,7 og høyhastighets atomkraftmikroskopi 8,9,10. Disse gir verdifull innsikt i membraners dynamiske sammensetning og struktur som påvirker membranbaserte reaksjoner11,12,13. Mens bevegelsen og lateral diffusjon av proteiner avhenger av den lokale tettheten av proteiner i membranen, kan individuelle proteinmolekyler også fanges i lipidflåter14 og ved protein-protein-interaksjoner15,16. Avhengig av proteindomenene som stikker ut fra membranen til det ekstracellulære miljøet eller cytosolen, kan proteinmobiliteten variere fra svært mobil til helt immobil. På grunn av membranens kompleksitet og dens perifere strukturer er det imidlertid ofte vanskelig å dechiffrere samspillet mellom arten av lateral mobilitet og proteinfunksjon17.
DIB-membraner har vist seg å være en effektiv plattform for biofysiske enkeltmolekylære analyser av membranproteiner 18,19,20,21,22. De dannes ved lipid selvmontering gjennom kontakt av vandige dråper med hydrogelstøttede substrater i en lipid / oljefase. I likhet med de ofte brukte støttede lipiddobbeltlagene (SLB)1,23,24,25, tillater DIB lokal innstilling av lateral mobilitet ved midlertidig eller permanent binding av proteiner til polymermatrisen når de funksjonaliseres med egnede ligander17. Sistnevnte kan tjene som et modellsystem for biokjemiske prosesser i cellemembraner med en heterogen proteinfordeling10.
Den eksperimentelle tilnærmingen beskrevet her er avhengig av fluorescensen av Ca 2+-følsomme fargestoffer for å måle Ca 2+ ionfluksen gjennom individuelle kanaler i nærheten av membranen 2,22 ved bruk av TIRF-mikroskopi. Denne optiske tilnærmingen begrenser belysningen av prøven til en avstand nær membranen, noe som på grunn av de fysiske egenskapene til det unnvikende eksitasjonslyset fører til en betydelig reduksjon av fluorescensbakgrunnen. Sistnevnte er en forutsetning dersom høy romlig og tidsmessig oppløsning er nødvendig for påvisning av enkeltmolekyler. I motsetning til klassiske elektrofysiologiske metoder26,27, kreves det ingen membranspenninger for å studere ionfluks gjennom individuelle kanaler. Videre krever metoden ikke merking med fluorescerende fargestoffer eller molekyler som kan forstyrre den laterale bevegelsen av kanalene i membranen.
Metoden er spesielt nyttig for å studere proteinkanaler innebygd i membranen på enkeltmolekylnivå uten å bruke klassisk elektrofysiologi. Ved å bruke mitokondriell proteinledende kanal TOM-CC fra Neurospora crassa28,29,30 og OmpF, som støtter diffusjonen av små hydrofile molekyler over den ytre membranen til Escherichia coli17,31, illustrerer vi hvordan membranmobilitetene og kanalaktivitetene til de to proteinene kan studeres og korreleres. Vi foreslår at denne tilnærmingen, selv om den er optimalisert for TOM-CC og OmpF, lett kan brukes på andre proteinkanaler.
Protokollen som presenteres her gir en innføring i bruk av DIB-membraner for å studere samspillet mellom lateral ionekanalbevegelse og kanalfunksjon ved hjelp av enkeltmolekylær TIRF-mikroskopi. For å få best mulig data er fremstilling av stabile DIB-membraner med flest mulig godt separerte kanaler avgjørende for å oppnå tidsserier av enkeltpartikler, som kan analyseres tilfredsstillende.
Kritiske parametere som skal optimaliseres inkluderer valg av lipid, lipidkonsentrasjonen i oljefasen og protein- og vaskemiddelkonsentrasjonene i de vandige dråpene. Lipidene som brukes er uvanlige, ved at de ikke viser noen klar faseovergang ved lave temperaturer. DPhPC er et vanlig lipid for å produsere stabile membransystemer40. I prinsippet kan ethvert lipid som opprettholder sitt væskemiljø ved lave temperaturer være egnet for denne applikasjonen. I tillegg bør lipidet ikke være følsomt for oksidasjon. Vaskemiddelkonsentrasjonen i dråpene bør være så lav som mulig for å unngå membranbrudd. Stabile membraner og gode proteininkorporeringshastigheter oppnås vanligvis med vaskemiddelkonsentrasjoner under den kritiske micellekonsentrasjonen (cmc), gitt at membranproteinet ikke felles ut.
Hvis DIB-membranene ikke tåler spesifikke vaskemidler21,41, eller hvis proteinene ikke integreres fra lavvaskemiddelløsning i DIB-membranene, kan proteinkanalene først rekonstitueres i små unilamellære lipidvesikler (SUVer), som deretter fusjoneres til DIB-membranene fra dråpesiden, slik det har blitt vist for E. coli MscL 42 . Noen ganger dannes ikke DIB-membraner fordi lipidkonsentrasjonen i oljefasen er for lav. For å forhindre at DIB-membraner sprekker, bør man også være oppmerksom på at det osmotiske trykket mellom hydrogelen og dråpen må balanseres nøyaktig uten å påvirke Ca2+-fluksen fra cis til trans for mye. Optimalisert agarosetykkelse og maskestørrelse synes å være avgjørende for å observere diffusjon av membranproteiner. Eventuell tørking av agaroselaget bør unngås. Tykkelsen kan bestemmes ved hjelp av atomkraftmikroskopi17. Ved å variere agarosekonsentrasjonen, volumet og rotasjonshastigheten under sentrifugeringsbelegget, kan maskestørrelsen og tykkelsen på hydrogelen optimaliseres. Vær imidlertid oppmerksom på at hydrogellagtykkelsen påvirker bildekontrasten. For å fange membranproteiner i DIB, kan agarosehydrogelen erstattes av spesialsyntetisert, ikke-tverrbundet, Ni-NTA-modifisert, lavsmeltende agarose for å fange dem via en His-tag17. En for høy fluorescensbakgrunn skyldes ofte brudd på DIB-membranene. Dette er spesielt et problem med flerbrønnskamre, da det Ca2+-følsomme fargestoffet diffunderer inn i hydrogelen. I dette tilfellet bør tilstøtende brønner unngås. Fluorescensbleking av det Ca2+-følsomme fargestoffet over membranen bør ikke være en signifikant begrensende faktor, da det byttes ut av ikke-eksiterte fargestoffer i hoveddelen av dråpen (figur 3A) utenfor TIRF-evanescentfeltet. Lokaliseringspresisjonen for proteinet er gitt av nøyaktigheten av montering av flekkene og pikselstørrelsen.
Svake fluorescenssignaler kan skyldes lav Ca2+-fluks gjennom kanalen. Mulige årsaker inkluderer: (i) unøyaktige TIRF-innstillinger (f.eks. laserintensitet), (ii) det osmotiske Ca 2+-trykket over membranen, eller (iii) kanalens indre Ca2+-permeabilitet er for lav. For å takle det første problemet må laserintensitet, TIRF-vinkel og kameraforsterkning optimaliseres. De to sistnevnte problemene kan overvinnes ved anvendelse av et elektrisk potensial over membranen 2,43. Imidlertid kan anvendelsen av eksterne spenninger forvride resultatet, da elektriske effekter kan påvirke kanalåpningen av ligandstyrte eller mekanosensitive ionkanaler som faktisk ikke er spenningsstyrte. Eksempler på slike kanaler er mitokondrieproteintranslokasen TOM-CC27 og dens kanaldannende underenhet Tom40 26,44,45,46. Til slutt skal det bemerkes at det er vanskelig å sette membranproteiner inn i DIB-membraner i en bestemt retning for å oppnå ønsket funksjonalitet, og kvantitative studier er sjeldne47,48. I noen tilfeller er orienteringen av de integrerte proteinene tilfeldig. Dette er et alvorlig problem for å studere membranproteiner, fordi visse membranproteiner aktiveres på bare den ene siden av membranen.
TIRF-mikroskopi er en kraftig metode for å håndtere enkeltmolekylære hendelser i plane støttede membraner49. Eksempler inkluderer montering og folding av veioppklaring av kanalproteiner som α-hemolysin50, perfringolysin O 51 og OmpG52. Disse studiene inkluderte FRET som tilleggsteknikk. I tillegg har aktivering av den mekanosensitive ionekanalen MscL tidligere blitt studert ved mekanisk stimulering av støttede DIB-dobbeltlag42 ved bruk av strømmålinger. Basert på dette arbeidet kan fremtidige studier kombinere plattformen beskrevet her med enkeltmolekylære FRET-eksperimenter for å adressere mekanosensitive kanaler på enkeltmolekylnivå på en optisk måte17. Injeksjon av buffer i dråpen, strekking av det indre DIB-monolaget eller målrettet binding av individuelle kanaler til den underliggende hydrogelen kan brukes til å studere ikke bare den fysiske mekanismen til mekanisk aktiverte kanaler, som reagerer på membranspenning og / eller krumning som vist for MscL og MscS, toporedomenet K +-kanaler, TREK-1, TREK-2, og TRAAK og PIEZO (for gjennomgang, se53), men også lokal binding til det cellulære cytoskjelettet, som vist for den berøringsfølsomme ionekanalen NOMPC54,55.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Beate Nitschke for hennes hjelp med proteintilberedning og Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) og Maximilan Ulbrich (Freiburg) for innsiktsfulle diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av Stuttgart Research Center Systems Biology (SRCSB) og et stipend fra Baden Württemberg Foundation (BiofMO-6 til SN).
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 | Nikon | MRD01991 | TIRF microscope |
10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25 | Nikon | Microscope to assess DIB membrane formation | |
10x objective N.A. 0.25 | Nikon | MRL00102 | TIRF microscope |
40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 | Nikon | Microscope to assess DIB membrane formation | |
488 nm laser, 100 mW | Visitron | TIRF microscope | |
Adhesive tape | |||
Äkta pure | Cytiva | Protein purification system | |
Bradford assay kit, Pierce | Thermo Fisher | 23236 | |
CaCl2 | Roth | 5239.2 | |
Chelax 100 resin | Biorad | 143-2832 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | MC1024452500 | |
Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO | Thermo Fisher | 87735 | |
DIB chamber | Custom made | PMMA chamber for DIB membranes | |
Digital power meter and energy console | Thorlabs | PM100D | Laser power meter |
Dimethyl sulfoxide | Roth | 4720.1 | |
Double distilled H2O | |||
Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope | Nikon | Microscope to assess DIB membrane formation | |
EDTA | Roth | 8042.2 | |
EMCCD camera iXon Ultra 897 | Andor | TIRF microscope | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
Fixed angle rotor Ti70 | Beckman Coulter | ||
Fluo-8, CalciFluorTM | Santa Cruz Biotechnology | SC-362561 | Ca2+-sensitive dye |
French press cell disruption homogenizer | Igneus | Igneus 40000 psi | |
GFP filter | AHF | Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source | |
Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | |
Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm | Roth | 1870.2 | |
Glycerol | Roth | 3783.2 | |
Hamilton syringe 10 mL | Roth | X033.1 | |
Hamilton syringe 100 mL | Roth | X049.1 | |
Hamilton syringe 500 mL | Roth | EY49.1 | |
Heating block | Eppendorf | Thermomixer comfort | |
Heating plate | Minitube | HT200 | |
Hepes | Roth | 9205.3 | |
Hexadcane | Sigma-Aldrich | 296317 | |
His Trap HP 1 mL | Cytiva | 29051021 | Ni-NTA column |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 1.04716.1000 | |
KCl | Honeywell | 10314243 | |
KLM spin coater | Schaefer Tec | SCV-10 | |
List medical L/M-3P-A vertical pipette puller | Artisan Technology Group | 57761-1 | |
Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
M8 Stereomicroscope | Wild | Stereomicrosope | |
Matlab | MathWorks | R2022a | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MicroFil pipette tips | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
N2 gas | |||
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Nanoliter 2010 injector | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | |
n-dodecyl-b-D-maltoside | Glycon Biochemicals | D97002-C | |
Ni-NTA agarose, non-crosslinked | Cube Biotech | 124115393 | Custom made |
NIS-Elements AR software | Nikon | MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 | Imaging software |
n-octyl-polyoxyethylene | Sigma-Aldrich | 40530 | |
O2 gas | |||
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Roth | 6367.3 | |
Photodiode sensor Si, 400 – 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | S130C | Sensor for laser power meter |
Plasma cleaner | Diener Electronics | Zepto | |
Preparative ultracentrifuge Optima | Beckman Coulter | ||
Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC | AHF | Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser | |
Resource Q 1 mL | Cytiva | 17117701 | Anion exchange column |
Silicon oil AR 20 | Sigma-Aldrich | 10836 | |
Sodium dodecyl sulfate | Roth | 2326.2 | |
Super LoLux camera | JVC | Stereomicrosope | |
Thermoshaker | Gerhardt | THL 500/1 | |
Ti-E Fluorescence microscope | Nikon | MEA53100 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 9090.3 | |
Tryptone | Roth | 8952.2 | |
Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | RK 100 | |
Vaccum pump | Vacuubrand | MD 4C NT | |
White light source for epifluorescence illumination (100 W) | Nikon | MBF72655 | TIRF microscope |
Yeast extract | Roth | 2363.2 | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |