Vi beskriver stegvisa protokoll som mäter mitokondriell andning hos mus- och humana neutrofiler och HL60-celler med hjälp av metabolisk extracellulär flödesanalysator.
Neutrofiler är den första försvarslinjen och de vanligaste leukocyterna hos människor. Dessa effektorceller utför funktioner som fagocytos och oxidativ burst och skapar neutrofila extracellulära fällor (NET) för mikrobiell clearance. Nya insikter i neutrofilernas metaboliska aktiviteter utmanar det tidiga konceptet att de främst förlitar sig på glykolys. Exakt mätning av metaboliska aktiviteter kan utveckla olika metaboliska behov av neutrofiler, inklusive trikarboxylsyra (TCA) -cykeln (även känd som Krebs-cykeln), oxidativ fosforylering (OXPHOS), pentosfosfatväg (PPP) och fettsyraoxidation (FAO) under fysiologiska förhållanden och i sjukdomstillstånd. Detta dokument beskriver ett steg-för-steg-protokoll och förutsättningar för att mäta syreförbrukningshastighet (OCR) som en indikator på mitokondriell andning på benmärgshärledda neutrofiler från mus, humana blod-härledda neutrofiler och den neutrofilliknande HL60-cellinjen, med hjälp av metabolisk flödesanalys på en metabolisk extracellulär flödesanalysator. Denna metod kan användas för att kvantifiera mitokondriella funktioner hos neutrofiler under normala och sjukdomsförhållanden.
Mitokondrier spelar en viktig roll i cellbioenergetik, som genererar adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS). Utöver detta sträcker sig mitokondriernas roll in i generering och avgiftning av reaktiva syrearter, cytoplasmatisk och mitokondriell matriskalciumreglering, cellulär syntes, katabolism och transport av metaboliter inom cellen1. Mitokondriell andning är avgörande i alla celler, eftersom deras dysfunktion kan leda till metaboliska problem 2, inklusive hjärt-kärlsjukdomar3 och en mängd olika neurodegenerativa sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration4, Parkinsons och Alzheimers sjukdomar5 och Charcot-Marie-Tooths sjukdom2 A (CMT2A)6.
Elektronmikroskopiska studier på neutrofiler avslöjade att det finns relativt få mitokondrier7, och de är starkt beroende av glykolys för sin energiproduktion eftersom mitokondriell andning är mycket låg8. Mitokondrier är dock avgörande för neutrofila funktioner, såsom kemotaxis9 och apoptos10,11,12. En tidigare studie avslöjade ett komplext mitokondriellt nätverk hos humana neutrofiler med hög membranpotential. Den mitokondriella membranpotentialförlusten är en tidig indikator på neutrofil apoptos10. Behandling med mitokondriell uncoupler karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) visade signifikant hämning i kemotaxi, tillsammans med en förändring i mitokondriell morfologi 9,10.
Även om den primära energikällan för neutrofiler är glykolys, tillhandahåller mitokondrier ATP som initierar neutrofilaktivering genom att driva den första fasen av purinergisk signalering, vilket ökar Ca2+ signalering, förstärker mitokondriell ATP-produktion och initierar neutrofila funktionella svar13. Dysfunktion i den mitokondriella andningskedjan resulterar i överdriven produktion av giftiga reaktiva syreradikaler (ROS) och leder till patogena skador14,15,16. NETosis, som är processen att bilda neutrofila extracellulära fällor (NET), är en kritisk egenskap hos neutrofiler som hjälper dem att bekämpa patogener17 och bidrar till många patologiska tillstånd, inklusive cancer, trombos och autoimmuna störningar18. Mitokondriellt härledd ROS bidrar till NETosis19, mitokondriellt DNA kan vara en komponent i NET18 och förändrad mitokondriell homeostas försämrar NETosis 20,21,22,23,24. Dessutom, under normal differentiering eller mognad, vänds neutrofil metabolisk omprogrammering genom att begränsa glykolytisk aktivitet, och de engagerar sig i mitokondriell andning och mobiliserar intracellulära lipider25,26.
Den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn kan kontinuerligt övervaka och kvantifiera levande cellmitokondriell andning och glykolys. Analysatorn använder en sensorpatron med 96 brunnar och två fluoroforer för att kvantifiera syrekoncentration (O2) och pH-förändringar. Sensorpatronen ligger ovanför cellmonoskiktet under analysen och bildar en ~ 200 nm hög mikrokammare. De optiska fiberbuntarna i analysatorn används för att excitera fluoroforerna och detektera de fluorescerande intensitetsförändringarna. Realtidsförändringar i O2-koncentration och pH beräknas automatiskt och visas som syreförbrukningshastighet (OCR) och extracellulär försurningshastighet (ECAR). Det finns fyra portar på sensorpatronen som gör det möjligt att ladda upp till fyra föreningar i varje brunn under analysmätningarna. Detta protokoll fokuserar på att kvantifiera mitokondriell andning hos mus och humana neutrofiler, såväl som neutrofilliknande HL60-celler, med hjälp av den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn.
Standardproceduren som mäter mitokondriell andning av neutrofiler med hjälp av den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn begränsas av många faktorer, inklusive cellantal, celltillväxt och livskraft. Varje föreningskoncentration varierar beroende på typ och källa till celler i denna analys. Oligomycin och rotenon / antimycin A används mest i en liknande koncentration bland de flesta celltyper. Eftersom den FCCP-inducerade maximala andningsfrekvensen varierar mellan olika celler krävs dock noggrann titr…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Dr. Anthony T. Vella och Dr. Federica Aglianoin från Institutionen för immunologi vid UConn Health för deras utbildning i att använda den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn och Dr. Lynn Puddington vid Institutionen för immunologi vid UConn Health för hennes stöd för instrumenten. Vi erkänner Dr. Geneva Hargis från UConn School of Medicine för hennes hjälp med vetenskapligt skrivande och redigering av detta manuskript. Denna forskning stöddes av bidrag från National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 och P20GM139763), en startfond från UConn Health och ett karriäråterinträdesstipendium från American Association of Immunologists.
37 °C non-CO2 incubator | Precision | Economy Model 2EG | Instrument |
Biorender | Software Application | ||
Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 102416-100 | Reagent |
EasySep Magnet | STEMCELL | 18000 | Magnet |
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit | STEMCELL | 19762A | Reagents |
Graphpad Prism 9 | Software Application | ||
Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
Ketamine (VetaKet) | DAILYMED | NDC 59399-114-10 | Anesthetic |
PBS | Cytiva | SH30256.01 | Reagents |
Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | polysaccharide solution |
Purified mouse anti-human CD18 antibody | Biolegend | 302102 | Clone TS1/18 |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11-875-093 | Reagents |
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer | Agilent | XFe96 | Instrument |
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | mitochondrial stress test Kit |
Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
Vactrap 2 Vacum Trap | Fox Lifesciences | 3052101-FLS | Instrument |
Wave | Software Application | ||
XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent | 103577-100 | Reagent |
XF 100 mM Pyruvate Solution | Agilent | 103578-100 | Reagent |
XF 200 mM Glutamine Solution | Agilent | 103579-100 | Reagent |
XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | Reagent |
XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Material |
Xylazine (AnaSed Injection) | DAILYMED | NDC 59399-110-20 | Anesthetic |