Summary

zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

Published: February 17, 2023
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Summary

이 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구성하기 위해 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 수행하는 방법을 설명합니다.

Abstract

CRISPR/Cas9 기술은 인간 유전 질환 모델링, 질병 발병기전 연구 및 약물 스크리닝을 위한 제브라피쉬의 가치를 높였지만, 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)로 인한 인간 유전 질환의 정확한 동물 모델을 만드는 데 있어 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 한계가 주요 장애물입니다. 지금까지 광범위한 PAM 호환성을 가진 일부 SpCas9 변종은 제브라피쉬에서 효율성을 보여주었습니다. 최적화된 SpRY 매개 아데닌 염기 편집기(ABE), zSpRY-ABE8e 및 합성 변형 gRNA를 제브라피쉬에 적용하면 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌-구아닌 염기 전환이 가능해졌습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬에서 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 위한 프로토콜입니다. zSpRY-ABE8e mRNA와 합성 변형 gRNA의 혼합물을 제브라피쉬 배아에 주입하여 TSR2 리보솜 성숙 인자(tsr2)의 병원성 부위를 시뮬레이션하는 정확한 돌연변이로 제브라피쉬 질병 모델을 구성했습니다. 이 방법은 질병 메커니즘 및 치료법을 연구하기 위한 정확한 질병 모델을 확립하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

Introduction

미스센스 또는 넌센스 돌연변이를 유발하는 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)는 인간 게놈1에서 가장 흔한 돌연변이 원인입니다. 특정 SNV가 병원성인지 여부를 확인하고 발병기전을 밝히기 위해서는 정확한 동물모델이 필요하다2. 제브라피쉬는 인간과 높은 수준의 생리적, 유전적 상동성, 짧은 발달 주기, 강력한 생식 능력을 나타내는 우수한 인간 질병 모델로, 병원성 특성 및 메커니즘에 대한 연구와 약물 스크리닝에 유리합니다3.

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템은 제브라피시4를 포함한 다양한 종의 게놈 편집에 널리 적용되었습니다. gRNA 유도를 통해 CRISPR/Cas9 시스템은 표적 부위에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있으며, 이는 상동성 지향 복구(HDR) 경로를 통해 표적 부위와 기증자 DNA 템플릿의 재조합을 통해 단일 염기 치환을 가능하게 합니다. 그러나, 이 염기 치환 방법의 효율은 매우 낮은데, 이는 세포 DNA 복구 과정이 주로 삽입 및 결실(indel) 돌연변이를 동반하는 비상동 말단 결합(non-homologous end-joining, NHEJ) 경로에 의해 수행되기 때문이다5. 다행스럽게도 CRISPR/Cas9 기반 단일 염기 편집 기술은 DSB를 유도하지 않고도 보다 효율적인 단일 염기 편집이 가능한 염기 편집기를 사용하여 이 문제를 크게 완화합니다. 염기 편집기의 두 가지 주요 클래스인 아데닌 염기 편집자(ABE)와 시토신 염기 편집자(CBE)는 A· T에서 G· C와 C·G에서 T· A는 각각 6,7,8,9,10,11이다. 이 4가지 유형의 염기 치환은 인간 병원성 변이체의 30%를 차지한다12. PmCDA1, BE 시스템, CBE4max, ABE7.10 및 ABE8e를 포함한 두 종류의 기본 편집기는 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 특히 BE4max 및 ABE8e는 높은 편집 활동 13,14,15,16,17,18,19를 달성하는 것으로 보고되었습니다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 큰개자리 개(S. canis)를 포함한 다양한 종의 Cas9 단백질이 제브라피쉬 유전자 편집에 구현되었으며, Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)가 가장 널리 사용되고 있습니다 20,21,22,23. 그러나, SpCas9는 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 있는 표적 부위만 인식할 수 있으며, 이는 편집 가능한 범위를 제한하고 병원성 관심 부위 근처에서 적절한 서열을 발견하지 못하게 할 수 있다24. 목표 범위를 확장하기 위해 다양한 SpCas9 변형이 유도 진화 및 구조 유도 설계를 통해 다양한 PAM을 인식하도록 설계되었습니다. 그러나 동물, 특히 제브라피쉬에서 효과적인 변종은 거의 없으며, 이는 SNV 관련 질병 연구에서 제브라피쉬의 적용을 제한합니다25,26,27,28. 최근에, 덜 엄격한 PAM 제한(NYN보다 NRN에 대한 선호도가 더 높은 SpG에 대한 NGN 및 SpRY에 대한 NNN)을 갖는 SpCas9, SpG 및 SpRY의 두 가지 변이체가 인간 세포 및 식물에서 높은 편집 활성을 나타내는 것으로 보고되었습니다 29,30,31,32. 그 후, SpG 및 SpRY뿐만 아니라 SpRY 매개 CBE 및 SpRY 매개 ABE와 같은 다수의 중재 기본 편집기도 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 이는 SNV 관련 질병의 기계론적 연구 및 약물 스크리닝에서 제브라피쉬 모델의 적용을 향상시킬 것입니다 18,33,34,35. 또한, i-Silence는 ATG에서 GTG 또는 ACG36으로의 ABE 매개 시작 코돈 전환을 통해 효과적이고 정확한 유전자 녹아웃 전략으로 제안되었습니다. i-Silence 전략과 SpRY 매개 베이스 편집기 zSpRY-ABE8e의 조합은 질병 모델링을 위한 새로운 방법을 제공한다(18). 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 zSpRY-ABE8e를 사용하여 유전자 편집을 수행하여 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 모델을 구성하는 방법을 보여줍니다. 제브라피쉬 모델에 나타나는 편집 효율성과 표현형을 평가하고 분석했습니다.

Protocol

본 연구는 화남사범대학 관리이용위원회의 지침을 엄격히 준수하여 수행되었다. 1. 합성 변형 gRNA 및 zSpRY-ABE8e mRNA 제조 이전 간행물37,38에 따라 gRNA를 설계합니다.zSpRY-ABE8e가 NYN PAM보다 NRN PAM에 대해 더 높은 선호도를 나타내므로(여기서, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임)18, PAM 서열로서 NRN?…

Representative Results

TSR2의 돌연변이는 다이아몬드 블랙팬 빈혈(DBA)을 유발하는 것으로 보고되었습니다42. 여기에서 DBA 제브라피쉬 모델은 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 돌연변이로 구성되었습니다. 제브라피쉬 tsr2의 시작 코돈의 아데닌은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 성공적으로 구아닌으로 전환되었습니다(그림 3). Sanger 염기서열 분석 결?…

Discussion

이 프로토콜은 기본 편집기 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬 질병 모델을 구성하는 방법을 설명합니다. 염기 치환을 위한 기존 HDR 경로와 비교할 때 이 프로토콜은 보다 효율적인 염기 편집을 달성하고 인델 발생을 줄일 수 있습니다. 동시에, 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 최근에 제안된 i-Silence 유전자 녹아웃 전략을 구현하는 것을 포함합니다. 종합하면, zSpRY-ABE8e는 질병 연구에서 제브라피쉬 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 원고 초안의 영어 텍스트를 편집해 주신 Liwen Bianji(Edanz)의 Barbara Garbers 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 광둥성 핵심 지역 연구 개발 프로그램(2019B030335001), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2019YFE0106700), 중국 국립 자연 과학 재단(32070819, 31970782), 광둥성 수생 경제 동물을 위한 병원성 생물학 및 역학 핵심 연구소의 연구 기금 프로그램(PBEA2020YB05).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A9539 1.5% Agarose used to make an injection plate
Borosilicate Glass Capillaries  Harvard Apparatus BS4 30-0016
Cell culture dishes  Falcon 351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit Vazyme C115 Kit for Infusion clone 
Codon optimization service Sangon Biotech
Drummond Microcaps Drummond Microcaps P1299-1PAK Length:32 mm, capacity:0.5 μL
EasyEdit gRNA service GenScript
Fine Forceps Fine Scientific Instrument 11254-20 Used to break meedle
Flaming/Brown Micropipette Puller  Stutter Instrument P-97 Used to pull the glass capillaries
HotStart Taq PCR StarMix Genstar A033-101 Used for PCR reaction
Intelligent artificial climate box TENLIN PRX-1000A Used to culture zebrafish embryos
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512 Used to fix zebrafish when photographing
Microloader pipette tips  Eppendorf 5242956003
mMACHINE kit 
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 Vazyme C214-01 Kit for site-directed mutagenesis
Pneumatic Microinjector ZGene Biotech ZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9 Addgene 46757
RNeasy FFPE kit  Qiagen 73504 Kit for RNA purification
Sanger Sequencing service Sangon Biotech
Sodium hydroxide, granular Sangon A100173-0500 NaOH used for genome extraction
Stereo Microscope Olympus  SZX10 Used for photograph of phenotype
SZ Series Zoom Stereo Microscope CNOPTEC SZ650
T3 mMESSAGE Ambion AM1348 Kit for in vitro transcription 
TIANprep Mini Plasmid Kit TIANGEN DP103-03 Kit for plasmid extraction kit
TIANquick Mini Purification Kit TIANGEN DP203-02 Kit for purification for linearized plasmid
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Used to anesthetize zebrafish
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sangon A600194-0500 Component of Tris·HCl used for genome extraction
XbaI New England Biolabs R0145S Restriction endonuclease used for plasmid linearization

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Zheng, S., Liang, F., Zhang, Y., Fei, J., Qin, W., Liu, Y. Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e. J. Vis. Exp. (192), e64977, doi:10.3791/64977 (2023).

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