Summary
Descriviamo un test qualitativo per l'adesione lievito e l'invasione agar come misura di differenziazione invasiva e pseudohyphal. Questo semplice test può essere utilizzato per valutare il fenotipo invasivo di vari mutanti così come i segnali effetti ambientali e vie di segnalazione sulla differenziazione lievito.
Abstract
I lieviti si trovano in biofilm naturali, dove molti microrganismi colonizzano superfici. In ambienti artificiali, come le superfici di oggetti artificiali, biofilm può ridurre la produttività industriale, distruggere le strutture, e minacciano la vita umana. 1-3 D'altra parte, sfruttando la potenza dei biofilm può aiutare a pulire l'ambiente e la produzione di energia sostenibile. 4-8 La capacità di S. cerevisiae per colonizzare superfici e partecipare a biofilm complesso è stato per lo più ignorata fino alla riscoperta dei programmi di differenziazione attivati da varie vie di segnalazione e stimoli ambientali in questo organismo. 9, 10 L'interesse di continuare ad utilizzare S. cerevisiae come organismo modello per comprendere l'interazione e la convergenza delle vie di segnalazione, come il Ras-PKA, MAPK Kss1 e Hog1 percorsi osmolarità, messo rapidamente S. cerevisiae nella giunzione di biofilm la biologia e la trasduzione del segnale di ricerca. 11-20 A tal fine, la differenziazione delle cellule di lievito in lungo, adesivi, filamenti pseudohyphal divenne una lettura utile per l'attivazione di vie di trasduzione del segnale su vari cambiamenti ambientali. Tuttavia, filamentazione è una raccolta di fenotipi complessi, il che rende il saggio di esso come se fosse un fenotipo semplice fuorviante. Negli ultimi dieci anni, alcuni saggi sono stati adottati con successo da studi biofilm batterici alla ricerca di lievito, come ad esempio la formazione MAT test per misurare la diffusione colonie su agar morbido e colorazione viola di cristallo per misurare quantitativamente superficie cellulare aderenza. 12, 21 Tuttavia, c'è stata una certa confusione nei test sviluppato per valutare qualitativamente i fenotipi adesivo e invasiva di lievito in agar. Qui, vi presentiamo un metodo semplice e affidabile per valutare la qualità adesiva e invasiva di ceppi di lievito di facile comprensione passi per isolare la valutazione di adesione dalla valutazione invasione. Il nostro metodo, adottato da studi precedenti, 10, 16 coinvolge le cellule crescono in mezzi liquidi e placcatura sul differenziale condizioni nutrienti per la crescita di grandi macchie, che poi lavare con acqua per valutare l'adesione e strofinare le cellule completamente dalla superficie agar per valutare l'invasione in l'agar. Si eliminano la necessità di striature cellule su agar, che colpisce l'invasione delle cellule in agar. In generale, abbiamo osservato che ceppi aploidi che invadono agar sono sempre adesivo, ma non tutti i ceppi adesivo può invadere il terreno di coltura. Il nostro approccio può essere utilizzato in combinazione con altri test per analizzare con attenzione i passi differenziazione e le esigenze della trasduzione del segnale di lievito, la differenziazione, quorum sensing, e formazione di biofilm.
Protocol
- Mettere 200ul di culture crescente di interessi sul sintetico piastre media con le condizioni di fame richiesti (SC con 2% di glucosio rispetto a SC di 0,2% di glucosio, per esempio) Se la densità di culture sono troppo diverse l'una dall'altra, regolare conteggio delle cellule per coltura 200ul così ogni goccia ha all'incirca la stessa quantità di cellule.
- Assicurati di tenere un registro di cui goccia sui piatti che è la cultura.
- Tenere socchiusa la piastra coperchio e lasciare a temperatura ambiente oa 30 ° C fino gocce sono asciutti.
- Piastre di tenuta con parafilm e guaina plastica (opzionale) e lasciare a 30 ° C per 3-7 giorni.
- Documento la crescita delle cellule su piastre (mediante scansione, di scattare una foto digitale, ecc)
- Lavare le cellule dalla superficie agar con acqua ad alta pressione (preferibilmente acqua distillata) per circa un minuto facendo attenzione per l'agar non per sollevare e cambiare l'orientamento.
- Eliminare l'acqua in eccesso toccando le piastre su carta assorbente e lasciarli aperti ad asciugare.
- Una volta che i piatti sono documento di adesione a secco su ogni piatto (per la scansione o scattare foto digitali)
- Cellule con un dito guantato, strofinare delicatamente fuori forma la superficie agar sotto l'acqua corrente per circa un minuto.
- Essiccare le piastre come prima.
- Se si utilizza un ambito dissezione, rimuovere l'ago prima di mettere le piastre sulla piattaforma microscopio.
- Invasione documento con ingrandimento 10x o 40x. Assicurarsi di mettere a fuoco la parte centrale di ogni cerchio, per i bordi saranno troppo affollate per vedere morfologie singola cella. I bordi può indicare il livello di crescita filamentosa e possono essere documentati per riferimento futuro. Scansione o scattare una foto digitale di tutta la piastra può anche essere utile.
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Discussion
Cellule di lievito differenziazione diverse modalità di visualizzazione a seconda della disponibilità di nutrienti e condizioni ambientali, compresa la formazione di spore in condizioni di fame e di stress, filamentazione sotto varie sollecitazioni dei nutrienti, e flocculazione. Lieviti, tra cui S. cerevisiae e C. albicans, si possono trovare anche nel biofilm formato da un insieme diversificato di microrganismi. Anche se vi è una certa correlazione con filamentazione e comportamento invasivo, non è chiaro esattamente come filamentazione potrebbe causare l'invasione e la colonizzazione delle superfici e dei tessuti. Lievito può certamente essere trovato in entrambe le forme vegetative e filamentosi in biofilm in natura così come luoghi in cui minacciano la salute umana, quali cateteri infetti e organi umani. 13/10 Al fine di comprendere le vie di segnalazione utilizzato dai lieviti per infettare gli animali e di partecipare a biofilm nocivi e benefici, dobbiamo sviluppare test accessibile e affidabile. Qui abbiamo sviluppato un saggio, adottato dal adesione già esistenti e disponibili per i saggi di invasione lievito, che ci permettono di determinare qualitativamente i fenotipi adesivo e invasiva di ceppi di lievito e mutanti in varie condizioni. Il test qui presentati elimina la necessità di striature di cellule di lievito sul agar, dove l'azione semplice striature sulla superficie agar cambia la qualità invasivo e adesivi di lievito. Imaging digitale di specie d'invasione delle cellule da un microscopio permette di semi-quantitative di valutazione del grado di invasione e di adesione. Tale rilevamento di cellule invasive e adesivo è gratuito il singolo agar test invasione delle cellule sviluppate dal laboratorio Sprague 9 e può essere adattato a fare esperimenti corso del tempo.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Lisa Schneper e Katrin Duevel per le loro intuizioni nello sviluppo di questo saggio.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
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