Summary

Standardiseret identifikation af sammensat struktur i tibetansk medicin ved hjælp af ionfældemassespektrometri og flertrinsfragmenteringsanalyse

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Her beskriver vi en generel protokol og design, der kan anvendes til at identificere spormængder og mindre bestanddele i de komplekse naturlige produktformuleringer (matrixer) i tibetansk medicin.

Abstract

Tibetanske lægemidler er komplekse og indeholder mange ukendte forbindelser, hvilket gør dybdegående forskning i deres molekylære strukturer afgørende. Væskekromatografi-elektrospray ionisering time-of-flight massespektrometri (LC-ESI-TOF-MS) er almindeligt anvendt til at ekstrahere tibetansk medicin; Imidlertid forbliver mange uforudsigelige ukendte forbindelser efter brug af spektrumdatabasen. Denne artikel udviklede en universel metode til identifikation af komponenter i tibetansk medicin ved hjælp af ionfældemassespektrometri (IT-MS). Metoden omfatter standardiserede og programmerede protokoller til prøveforberedelse, MS-indstilling, LC-prerun, metodeetablering, MS-erhvervelse, flertrins MS-drift og manuel dataanalyse. To repræsentative forbindelser i den tibetanske medicin Abelmoschus manihot frø blev identificeret ved anvendelse af flertrinsfragmentering med en detaljeret analyse af typiske sammensatte strukturer. Derudover diskuterer artiklen aspekter som valg af iontilstand, mobil fasejustering, optimering af scanningsområde, kollisionsenergikontrol, kollisionstilstandsskift, fragmenteringsfaktorer og begrænsninger ved metoden. Den udviklede standardiserede analysemetode er universel og kan anvendes på ukendte forbindelser i tibetansk medicin.

Introduction

Den kvalitative analyse af sporkomponenter i traditionel kinesisk medicin (TCM) er blevet et afgørende emne i forskningen. På grund af det høje antal forbindelser i TCM er det vanskeligt at isolere dem til kernemagnetisk resonansspektrometer (NMR) eller røntgendiffraktometer (XRD) analyse, hvilket gør massespektrometri (MS) -baserede metoder, der kun kræver lave prøvevolumener, stadig mere populære. Derudover har væskekromatografi (LC) kombineret med MS været meget udbredt i TCM-forskning i de senere år til forbedret adskillelse af komplekse prøver og kvalitativ analyse af kemiske forbindelser1. En almindelig metode er væskekromatografi-elektrospray ionisering time-of-flight massespektrometri (LC-ESI-TOF-MS), som er meget udbredt i kvalitativ forskning om tibetansk medicin2. Med denne metode beriges og adskilles komplekse komponenter i en LC-kolonne, og masse-til-ladningsforholdet (m / z) af adduktionionerne observeres ved anvendelse af en MS-detektor. Søgning i tandem MS (MS / MS eller MS2) databaser er i øjeblikket den hurtigste tilgang til sikre sammensatte annoteringer i små molekyleanalyser ved hjælp af quadrupole time-of-flight (Q-TOF) MS og Orbitrap MS3. Den dårlige kvalitet af databaser og tilstedeværelsen af forskellige isomerer hindrer imidlertid identifikationen af ukendte forbindelser. Desuden er oplysningerne i MS/MS-databasen begrænsettil 4,5,6,7. Det er vigtigt at undersøge de kemiske forbindelser i hver TCM ved hjælp af en generel protokol, der kan anvendes bredt på andre TCM.

IT-MS fanger en bred vifte af ioner ved at anvende forskellige radiofrekvensspændinger (RF) på ringelektroderne8. IT-MS kan udføre tidsserier MS-scanninger i flere trin i forskellige kronologiske rækkefølger, hvilket giver ingrediensfragmentering i flere trin MS (MS n), hvorn er antallet af produktionstadier9. Lineær IT-MS betragtes som den bedste til strukturidentifikation, da den kan bruges til sekventielle MSn-eksperimenter 10. Målrettede ioner kan isoleres og akkumuleres i lineær IT-MS1. MS n (n ≥ 3) i IT-MS giver flere fragmentoplysninger end MS/MS i Q-TOF-MS. Da IT-MS ikke kan låse målionen og dens fragmentioner, er det et kraftfuldt værktøj til strukturbelysning af ukendte forbindelser, herunder isomerer1. MSn-teknologi er blevet anvendt i vid udstrækning til strukturel analyse af ukendte proteiner, peptider og polysaccharider11,12. Tæthedsniveauet af fragmentioner i MSn giver mere molekylær fragmentinformation om målrettede forbindelser i komplekse prøver end MS / MS i Q-TOF-MS. Derfor er det vigtigt at anvende MSn-teknologi til strukturel identifikation i TCM.

Tibetansk medicin er en væsentlig bestanddel af TCM13, og disse lægemidler stammer primært fra dyr, planter og mineraler, der findes i plateauområdet14. Den tibetanske medicin Abelmoschus manihot frø (AMS) er frøet af Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS er en traditionel urtemedicin, der anvendes til behandling af tilstande som atopisk dermatitis, gigt og spedalskhed. Den indeholder chalcon, som besidder antibakterielle, svampedræbende, anticancer, antioxidative og antiinflammatoriske virkninger15. I denne undersøgelse blev MS n-procedurerne forbedret, og der blev udviklet en detaljeret metode til at identificere sammensatte strukturer i den tibetanske medicin AMS ved hjælp af IT-MS og MSn. Visse MS-parametre, herunder iontilstand, scanningsområde og kollisionstilstand, blev optimeret til at overvinde problemer med at identificere sporforbindelser. Denne undersøgelse har til formål at fremme standardiseret strukturidentifikation af sporstoffer i TCM.

Protocol

1. Forberedelse af prøver 1 g af AMS-prøven vejes nøjagtigt, og den anbringes i en konisk kolbe med 30 ml 80% methanol. Overfør blandingen til en ultralydbad sonikator i 30 minutters ekstraktion ved 25 ° C. Centrifuger prøven ved 14.000 x g i 5 min.BEMÆRK: Frekvensen af ultralydbad sonikator er 40 KHz. Klargør en injektionssprøjte og et mikroporøst membranfilter (0,22 μm, kun organisk). Supernatanten filtreres ned i en prøveflaske på 2 ml. <p class…

Representative Results

Cellobiose blev brugt som model til at verificere gennemførligheden af MSn i positiv iontilstand. Som vist i figur 2A producerede ESI-MS (positiv iontilstand) af cellobiose [C12H22O11]+ det protonerede molekyle [M+H]+ ved m/z 365. Produktionscanningen (CID-MS/MS) af [M+H]+ ved m/z 365 resulterede i den anden fragmention ved m/z 305 (figur 2B), som blev yderligere analyseret ved hjælp af MS3- og MS4…

Discussion

IT-MS og dets MSn-teknologi tilbyder en ny tilgang til at identificere strukturen af spor TCM-forbindelser. I modsætning til Q-TOF-MS, som ikke dybt kunne identificere fragmentionerne, udmærker IT-MS med MSn-teknologi sig på grund af dets evne til at isolere og akkumulere ioner. Denne artikel skitserer en metode til identifikation af sporstoffer i tibetansk medicin ved hjælp af IT-MS og MS n-teknikken. Metoden anvender n-værdien i MSn til at bestemme mængden af fragmentio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af Xinglin Talent Program fra Chengdu University of TCM (nr. 030058191), Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) og National Natural Science Foundation of China (82204765).

Materials

Acetonitrile Thermo Scientific CAS 75-05-8 LC-MS grade
Formic Acid Knowles CAS 64-18-6 HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ XL
liquid chromatograph Thermo Scientific U3000
LTQ Tune Thermo Scientific version 2.8.0 MS control software
Methanol Thermo Scientific CAS 67-56-1 LC-MS grade
Pure water Thermo Scientific CAS 7732-18-5 LC-MS grade
Xcalibur Thermo Scientific version 2.0 LC-IT-MS operational software

References

  1. Chen, X. -. F., Wu, H. -. T., Tan, G. -. G., Zhu, Z. -. Y., Chai, Y. -. F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
  2. Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).
  3. Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
  4. Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).
  5. Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).
  6. Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).
  7. Chang, H. -. L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).
  8. Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
  9. Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).
  10. Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
  11. Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
  12. Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
  13. Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. Modern research of Tibetan medicine. World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).
  14. Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), 390-400 (2012).
  15. Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).
  16. Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , (2022).
  17. Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
  18. Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
  19. Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
  20. Wu, S. -. L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
  21. Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).

Play Video

Cite This Article
Fu, X., Pan, Y., Wang, Y., Pei, Z., Xu, B., Zhang, J., Su, J. Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis. J. Vis. Exp. (193), e65054, doi:10.3791/65054 (2023).

View Video