Summary

Standardisert identifisering av sammensatt struktur i tibetansk medisin ved hjelp av ionefellemassespektrometri og flertrinns fragmenteringsanalyse

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Her beskriver vi en generell protokoll og design som kan brukes til å identifisere spormengder og mindre bestanddeler i de komplekse naturlige produktformuleringene (matriser) i tibetansk medisin.

Abstract

Tibetanske medisiner er komplekse og inneholder mange ukjente forbindelser, noe som gjør grundig forskning på deres molekylære strukturer avgjørende. Væskekromatografi-elektrospray ionisering time-of-flight massespektrometri (LC-ESI-TOF-MS) brukes ofte til å trekke ut tibetansk medisin; Imidlertid forblir mange uforutsigbare ukjente forbindelser etter bruk av spektrumdatabasen. Denne artikkelen utviklet en universell metode for å identifisere komponenter i tibetansk medisin ved hjelp av ionefellemassespektrometri (IT-MS). Metoden inkluderer standardiserte og programmerte protokoller for prøvepreparering, MS-innstilling, LC-prerun, metodeetablering, MS-oppkjøp, flertrinns MS-drift og manuell dataanalyse. To representative forbindelser i tibetansk medisin Abelmoschus manihot frø ble identifisert ved hjelp av flertrinns fragmentering, med en detaljert analyse av typiske sammensatte strukturer. I tillegg diskuterer artikkelen aspekter som ionmodusvalg, mobil fasejustering, skanningsområdeoptimalisering, kollisjonsenergikontroll, kollisjonsmodusovergang, fragmenteringsfaktorer og begrensninger av metoden. Den utviklede standardiserte analysemetoden er universell og kan brukes på ukjente forbindelser i tibetansk medisin.

Introduction

Den kvalitative analysen av sporkomponenter i tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har blitt et avgjørende tema i forskning. På grunn av det høye antallet forbindelser i TCM, er det vanskelig å isolere dem for kjernemagnetisk resonansspektrometer (NMR) eller røntgendiffraktometer (XRD) analyse, noe som gjør massespektrometri (MS) -baserte metoder som bare krever lave prøvevolumer stadig mer populære. I tillegg har væskekromatografi (LC) kombinert med MS blitt mye brukt i TCM-forskning de siste årene for forbedret separasjon av komplekse prøver og kvalitativ analyse av kjemiske forbindelser1. En vanlig metode er væskekromatografi-elektrosprayionisering time-of-flight massespektrometri (LC-ESI-TOF-MS), som er mye brukt i kvalitativ forskning på tibetansk medisin2. Med denne metoden blir komplekse komponenter anriket og separert i en LC-kolonne, og masse-til-ladningsforholdet (m / z) av adduktionene observeres ved hjelp av en MS-detektor. Søk i tandem MS (MS / MS eller MS2) databaser er for tiden den raskeste tilnærmingen for sikre sammensatte merknader i småmolekylanalyse ved bruk av quadrupole time-of-flight (Q-TOF) MS og Orbitrap MS3. Den dårlige kvaliteten på databaser og tilstedeværelsen av forskjellige isomerer hindrer imidlertid identifiseringen av ukjente forbindelser. I tillegg er informasjonen fra MS/MS-databasen begrensettil 4,5,6,7. Det er viktig å undersøke de kjemiske forbindelsene i hver TCM ved hjelp av en generell protokoll som kan brukes mye på andre TCM.

IT-MS fanger opp et bredt spekter av ioner ved å bruke forskjellige radiofrekvensspenninger (RF) på ringelektrodene8. IT-MS kan utføre tidsserier i flere trinn MS-skanninger i forskjellige kronologiske rekkefølger, og gir ingrediens flertrinns MS (MS n) fragmentering, hvorn er antall produktiontrinn9. Lineær IT-MS regnes som den beste for strukturidentifikasjon, da den kan brukes til sekvensielle MSn-eksperimenter 10. Målrettede ioner kan isoleres og akkumuleres i lineær IT-MS1. MS n (n ≥ 3) i IT-MS gir mer fragmentinformasjon enn MS/MS i Q-TOF-MS. Siden IT-MS ikke kan låse målionet og dets fragmentioner, er det et kraftig verktøy for strukturoppklaring av ukjente forbindelser, inkludert isomerer1. MSn-teknologi har blitt mye brukt til strukturell analyse av ukjente proteiner, peptider og polysakkarider11,12. Overflodsnivået av fragmentioner i MSn gir mer molekylær fragmentinformasjon om målrettede forbindelser i komplekse prøver enn MS / MS i Q-TOF-MS. Derfor er det viktig å bruke MSn-teknologi til strukturell identifikasjon i TCM.

Tibetansk medisin er en betydelig komponent i TCM13, og disse medisinene er hovedsakelig avledet fra dyr, planter og mineraler som finnes i platåområdet14. Den tibetanske medisinen Abelmoschus manihot seeds (AMS) er frøet til Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS er en tradisjonell urtemedisin som brukes til å behandle tilstander som atopisk dermatitt, revmatisme og spedalskhet. Den inneholder chalcone, som har antibakterielle, antifungale, anticancer, antioksidative og antiinflammatoriske effekter15. I denne studien ble MS n prosedyrer forbedret, og en detaljert metode ble utviklet for å identifisere sammensatte strukturer i den tibetanske medisinen AMS ved hjelp av IT-MS og MSn. Visse MS-parametere, inkludert ionmodus, skanneområde og kollisjonsmodus, ble optimalisert for å overvinne problemer med å identifisere sporforbindelser. Denne studien tar sikte på å fremme standardisert strukturidentifikasjon av sporforbindelser i TCM.

Protocol

1. Forberedelse av prøver Vei nøyaktig 1 g av AMS-prøven, og legg den i en konisk kolbe med 30 ml 80% metanol. Overfør blandingen til en ultralydbadsonikator i 30 minutter ekstraksjon ved 25 ° C. Sentrifuger prøven ved 14 000 x g i 5 minutter.MERK: Frekvensen av ultralydbadets sonikator er 40 KHz. Klargjør en injeksjonssprøyte og et mikroporøst membranfilter (0,22 μm, kun organisk). Filtrer supernatanten over i en 2 ml prøveflaske. <p class="jove_tit…

Representative Results

Cellobiose ble brukt som en modell for å verifisere muligheten for MSn i positiv ionmodus. Som vist i figur 2A, produserte ESI-MS (positiv ionemodus) av cellobiose [C 12 H22O11] + det protonerte molekylet [M + H] + ved m / z 365. Produktioneskanningen (CID-MS/MS) av [M+H]+ ved m/z 365 resulterte i det andre fragmentionet ved m/z 305 (figur 2B), som ble videre analysert ved hjelp av MS3- og MS4-analy…

Discussion

IT-MS og MSn-teknologien tilbyr en ny tilnærming til å identifisere strukturen til spor-TCM-forbindelser. I motsetning til Q-TOF-MS, som ikke kunne identifisere fragmentionene dypt, utmerker IT-MS med MSn-teknologi seg på grunn av sin evne til å isolere og akkumulere ioner. Denne artikkelen skisserer en metode for å identifisere sporforbindelser i tibetansk medisin ved hjelp av IT-MS og MSn teknikk. Metoden benytter n-verdien i MSn for å bestemme mengden fragmentioninform…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av Xinglin Talent Program ved Chengdu University of TCM (nr. 030058191), Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) og National Natural Science Foundation of China (82204765).

Materials

Acetonitrile Thermo Scientific CAS 75-05-8 LC-MS grade
Formic Acid Knowles CAS 64-18-6 HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ XL
liquid chromatograph Thermo Scientific U3000
LTQ Tune Thermo Scientific version 2.8.0 MS control software
Methanol Thermo Scientific CAS 67-56-1 LC-MS grade
Pure water Thermo Scientific CAS 7732-18-5 LC-MS grade
Xcalibur Thermo Scientific version 2.0 LC-IT-MS operational software

References

  1. Chen, X. -. F., Wu, H. -. T., Tan, G. -. G., Zhu, Z. -. Y., Chai, Y. -. F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
  2. Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).
  3. Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
  4. Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).
  5. Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).
  6. Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).
  7. Chang, H. -. L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).
  8. Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
  9. Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).
  10. Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
  11. Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
  12. Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
  13. Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. Modern research of Tibetan medicine. World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).
  14. Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), 390-400 (2012).
  15. Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).
  16. Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , (2022).
  17. Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
  18. Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
  19. Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
  20. Wu, S. -. L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
  21. Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).

Play Video

Cite This Article
Fu, X., Pan, Y., Wang, Y., Pei, Z., Xu, B., Zhang, J., Su, J. Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis. J. Vis. Exp. (193), e65054, doi:10.3791/65054 (2023).

View Video