Summary

Netzwerk Pharmakologische Vorhersage und metabolomische Validierung des Mechanismus von Fructus phyllanthi gegen Hyperlipidämie

Published: April 07, 2023
doi:

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine integrierte Strategie zur Erforschung der wichtigsten Ziele und Mechanismen von Fructus Phyllanthi gegen Hyperlipidämie, basierend auf der Vorhersage der Netzwerkpharmakologie und der Verifizierung der Metabolomik.

Abstract

Hyperlipidämie ist weltweit zu einem der führenden Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Leberschäden geworden. Fructus Phyllanthi (FP) ist ein wirksames Medikament gegen Hyperlipidämie in den Theorien der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) und der Indischen Medizin, der potenzielle Mechanismus muss jedoch weiter erforscht werden. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, den Mechanismus der FP gegen Hyperlipidämie aufzudecken, basierend auf einer integrierten Strategie, die die Vorhersage der Netzwerkpharmakologie mit der Validierung der Metabolomik kombiniert. Ein durch fettreiche Diät (HFD) induziertes Mäusemodell wurde durch die Auswertung der Plasmalipidspiegel erstellt, einschließlich Gesamtcholesterin (TC), Triglycerid (TG), Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin (LDL-C) und High-Density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C). Die Netzwerkpharmakologie wurde angewendet, um die Wirkstoffe von FP und mögliche Angriffspunkte gegen Hyperlipidämie herauszufinden. Metabolomik von Plasma und Leber wurde durchgeführt, um differentielle Metaboliten und ihre entsprechenden Signalwege zwischen der Normalgruppe, der Modellgruppe und der Interventionsgruppe zu identifizieren. Die Beziehung zwischen Netzwerkpharmakologie und Metabolomik wurde weiter konstruiert, um einen umfassenden Überblick über den Prozess der FP gegen Hyperlipidämie zu erhalten. Die erhaltenen Schlüsselzielproteine wurden durch molekulares Andocken verifiziert. Diese Ergebnisse spiegelten wider, dass FP die Plasmalipidspiegel und die Leberschädigung der durch eine HFD induzierten Hyperlipidämie verbesserte. Gallussäure, Quercetin und Beta-Sitosterol in FP wurden als die wichtigsten Wirkstoffe nachgewiesen. Insgesamt wurden 16 bzw. sechs potentielle differentielle Metaboliten im Plasma bzw. in der Leber gefunden, die an den therapeutischen Effekten von FP gegen Hyperlipidämie durch Metabolomik beteiligt sind. Darüber hinaus zeigte die Integrationsanalyse, dass die Interventionseffekte mit CYP1A1, AChE und MGAM sowie mit der Anpassung von L-Kynurenin, Corticosteron, Acetylcholin und Raffinose assoziiert waren, wobei hauptsächlich der Tryptophan-Stoffwechselweg beteiligt war. Molekulares Docking stellte sicher, dass die oben genannten Inhaltsstoffe, die auf Hyperlipidämie-bedingte Proteinziele wirken, eine Schlüsselrolle bei der Senkung der Lipide spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Forschung eine neue Möglichkeit zur Vorbeugung und Behandlung von Hyperlipidämie bietet.

Introduction

Hyperlipidämie ist eine häufige Stoffwechselerkrankung mit schwerwiegenden Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und auch der Hauptrisikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen1. In jüngster Zeit ist ein altersbedingter Abwärtstrend für diese Krankheit zu beobachten, und jüngere Menschen sind aufgrund eines langfristig unregelmäßigen Lebensstils und ungesunder Essgewohnheiten anfälliger geworden2. In der Klinik wurden verschiedene Medikamente zur Behandlung von Hyperlipidämie eingesetzt. Eines der am häufigsten verwendeten Medikamente für Patienten mit Hyperlipidämie und verwandten atherosklerotischen Störungen sind beispielsweise Statine. Die langfristige Einnahme von Statinen hat jedoch nicht zu vernachlässigende Nebenwirkungen, die zu einer schlechten Prognose führen, wie z. B. Unverträglichkeit, Therapieresistenz und unerwünschte Ereignisse 3,4. Diese Unzulänglichkeiten sind für Hyperlipidämie-Patienten zu zusätzlichen Schmerzen geworden. Daher sollten neuartige Behandlungen für eine stabile lipidsenkende Wirksamkeit und weniger Nebenwirkungen vorgeschlagen werden.

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) wird aufgrund ihrer guten Wirksamkeit und ihrer geringen Nebenwirkungen häufig zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt5. Fructus Phyllanthi (FP), die Trockenfrucht von Phyllanthus emblica Linn. (im Volksmund als Amla-Beere oder indische Stachelbeere bekannt), ist ein berühmtes Medizin- und Lebensmittel-homologes Material der traditionellen chinesischen und indischen Medizin 6,7. Dieses Arzneimittel wurde gemäß den TCM-Theorien8 verwendet, um Hitze zu beseitigen, das Blut zu kühlen und die Verdauung zu fördern. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass FP reich an bioaktiven Verbindungen wie Gallussäuren, Ellagsäuren und Quercetin9 ist, die für eine Reihe facettenreicher biologischer Eigenschaften verantwortlich sind, indem sie als Antioxidans, entzündungshemmend, leberschützend, antihypolipidämisch usw. wirken10. Neuere Forschungen haben auch gezeigt, dass FP die Blutfette von Patienten mit Hyperlipidämie effektiv regulieren kann. Zum Beispiel haben Variya et al.11 gezeigt, dass FP-Fruchtsaft und sein chemischer Hauptbestandteil Gallussäure den Plasmacholesterinspiegel senken und das Eindringen von Öl in Leber und Aorta verringern können. Die therapeutische Wirksamkeit hing mit der Regulation von FP zusammen, die Expression von Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor-alpha zu erhöhen und die hepatische lipogene Aktivität zu verringern. Der zugrunde liegende Mechanismus von FP bei der Verbesserung der Hyperlipidämie sollte jedoch weiter untersucht werden, da seine bioaktiven Inhaltsstoffe recht umfangreich sind. Wir haben versucht, den potenziellen Mechanismus der therapeutischen Wirksamkeit von FP zu untersuchen, der für die weitere Entwicklung und Anwendung dieses Arzneimittels von Vorteil sein könnte.

Gegenwärtig wird die Netzwerkpharmakologie als ganzheitliche und effiziente Technik angesehen, um den therapeutischen Mechanismus der TCM zu untersuchen. Anstatt nach einzelnen krankheitsverursachenden Genen und Medikamenten zu suchen, die nur ein einzelnes Ziel behandeln, wird ein vollständiges Netzwerk von Arzneimitteln, Inhaltsstoffen, Genen und Krankheiten aufgebaut, um den Multi-Zielmechanismus des Arzneimittels mit mehreren Inhaltsstoffen in Bezug auf ihre umfassende Behandlung zu finden12. Diese Technik eignet sich besonders für die TCM, da ihre chemische Zusammensetzung massiv ist. Leider kann die Netzwerkpharmakologie nur theoretisch zur Vorhersage von Zielen verwendet werden, die von chemischen Inhaltsstoffen beeinflusst werden. Die endogenen Metaboliten im Krankheitsmodell sollten beobachtet werden, um die Wirksamkeit der Netzwerkpharmakologie zu validieren. Die Metabolomik-Methode, die mit der Entwicklung der Systembiologie auftaucht, ist ein wichtiges Werkzeug zur Überwachung der Veränderungen in endogenen Metaboliten13. Die Veränderungen der Metaboliten spiegeln die stationären Zustandsänderungen des Wirts wider, was auch ein wichtiger Indikator für die Untersuchung des internen Mechanismus ist. Einigen Forschern ist es gelungen, Netzwerkpharmakologie und Metabolomik zu integrieren, um den Interaktionsmechanismus zwischen Medikamenten und Krankheiten zu erforschen14,15.

Dieser Artikel untersucht die mechanistischen Grundlagen der FP gegen Hyperlipidämie durch die Integration von Netzwerkpharmakologie und Metabolomik-Techniken. Die Netzwerkpharmakologie wurde angewendet, um die Beziehung zwischen den Hauptwirkstoffen in FP und molekularen Zielen für Hyperlipidämie zu analysieren. Anschließend wurde eine Metabolomik durchgeführt, um die Veränderung der endogenen Metaboliten im Tiermodell zu beobachten, was die Arzneimittelwirkung auf metabolischer Ebene erklären kann. Verglichen mit der alleinigen Anwendung der Netzwerkpharmakologie oder Metabonomik bot diese integrierte Analyse einen spezifischeren und umfassenderen Forschungsmechanismus. Darüber hinaus wurde die molekulare Docking-Strategie verwendet, um die Interaktion zwischen Wirkstoffen und Schlüsselproteinen zu analysieren. Im Allgemeinen könnte dieser integrierte Ansatz den Mangel an experimenteller Evidenz für die Netzwerkpharmakologie und das Fehlen eines endogenen Mechanismus für die Metabolomik-Methode kompensieren und für die Analyse des therapeutischen Mechanismus der Naturheilkunde verwendet werden. Das schematische Hauptflussdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protocol

Alle Verfahren, die den Umgang mit Tieren betreffen, wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Universität Chengdu durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Chengdu genehmigt (Protokollnummer 2020-36). Für die vorliegende Studie wurden männliche C57BL/6-Mäuse (20 ± 2 g) verwendet. Die Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle). <p class=…

Representative Results

Netzwerk PharmakologieInsgesamt wurden 18 potentielle Inhaltsstoffe in FP nach ihren pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften aus der Datenbank und der LC-MS-Analyse gescreent (die Gesamtionenchromatogramme sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt). In der einschlägigen Literatur wird darauf hingewiesen, dass der Gehalt an Gallussäure viel höher ist als bei anderen Inhaltsstoffen und die Lipide wirksam senkt 9,11<sup clas…

Discussion

In den letzten Jahren ist die Inzidenzrate von Hyperlipidämien gestiegen, was vor allem auf langfristige ungesunde Essgewohnheiten zurückzuführen ist. Die TCM und ihre chemischen Inhaltsstoffe haben verschiedene pharmakologische Aktivitäten, die in den letzten Jahren umfassend untersucht wurden37,38. FP ist eine Art Fruchtressource, die sowohl als Medizin als auch als Lebensmittel verwendet wird und ein wichtiges Potenzial zur Behandlung von Hyperlipidämie h…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde durch das Produktentwicklungs- und Innovationsteam der TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) und Research on New Business Cross-border Integration of “Health Preservation and Rehabilitation+” unterstützt.

Materials

101-3B Oven Luyue Instrument and Equipment Factory
80312/80302 Glass Slide Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD
80340-1630 Cover Slip Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) Thermo Fisher Scientific
Acetonitrile Fisher Chemical A998 Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) Thermo Fisher Scientific
Aethanol Fisher Chemical A995 Version 3.0
Ammonia Solution Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1336-21-6 Version 3.9.1
AutoDockTools Scripps Institution of Oceanography
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.
Compound Discoverer Thermo Fisher Scientific
Cytoscape Cytoscape Consortium
DM500 Optical Microscope Leica
DV215CD Electronic Balance Ohaus Corporation ., Ltd T15A63
Ethyl Alcohol Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 64-17-5
Formic Acid Fisher Chemical A118
HDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A112-1-1
Hematoxylin Staining Solution Biosharp BL700B
High Fat Diet ENSIWEIER 202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge Hitachi., Ltd.
Homogenizer Oulaibo Technology Co., Ltd
Hydrochloric Acid Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 7647-01-0
Image-forming System LIOO
JB-L5 Freezer Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd
JB-L5 Tissue Embedder Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd
JK-5/6 Microtome Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd
JT-12S Hydroextractor Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd
KQ3200E Ultrasonic Cleaner Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd
LDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A113-1-1
Male C57BL/6 Mice  SBF Biotechnology Co., Ltd. Version 2.3.2
Neutral Balsam Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd 10021190865934
Pure Water Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd GB19298
PyMOL DeLano Scientific LLC Version 14.1
RE-3000 Rotary Evaporator Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd
RM2016 Pathological Microtome Shanghai Leica Instruments Co., Ltd Version 26.0
SIMCA-P Umetrics AB
Simvastatin Merck Sharp & Dohme., Ltd 14202220051
SPSS International Business Machines Corporation
TC Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A111-1-1
TG Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry Thermo Fisher Scientific
Vortex Vibrator Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. LC-Vortex-P1
Xylene Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1330-20-7

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Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N., Wang, J., Nie, K., Xia, L., Yu, S. Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia. J. Vis. Exp. (194), e65071, doi:10.3791/65071 (2023).

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