Denne protokol vurderer Drosophilas lokomotoriske aktivitet ved at spore og analysere fluernes bevægelse i en håndlavet arena ved hjælp af open source-software Fiji, kompatibel med plugins til at segmentere pixels i hver ramme baseret på high-definition videooptagelse for at beregne parametre for hastighed, afstand osv.
Drosophila melanogaster er en ideel modelorganisme til at studere forskellige sygdomme på grund af dens overflod af avancerede genetiske manipulationsteknikker og forskellige adfærdsmæssige træk. Identifikation af adfærdsmangel i dyremodeller er et afgørende mål for sygdommens sværhedsgrad, for eksempel i neurodegenerative sygdomme, hvor patienter ofte oplever forringelser i motorisk funktion. Men med tilgængeligheden af forskellige systemer til at spore og vurdere motoriske underskud i fluemodeller, såsom lægemiddelbehandlede eller transgene individer, mangler der stadig et økonomisk og brugervenligt system til præcis evaluering fra flere vinkler. En metode baseret på AnimalTracker applikationsprogrammeringsgrænsefladen (API) udvikles her, som er kompatibel med Fiji-billedbehandlingsprogrammet, til systematisk at evaluere bevægelsesaktiviteterne hos både voksne og larveindivider fra optaget video, hvilket muliggør analyse af deres sporingsadfærd. Denne metode kræver kun et high-definition kamera og en computer perifer hardware integration til at registrere og analysere adfærd, hvilket gør det til en overkommelig og effektiv tilgang til screening af fluemodeller med transgene eller miljømæssige adfærdsmæssige mangler. Eksempler på adfærdstest med farmakologisk behandlede fluer gives for at vise, hvordan teknikkerne kan detektere adfærdsændringer hos både voksne fluer og larver på en meget gentagelig måde.
Drosophila melanogaster giver en fremragende modelorganisme til undersøgelse af cellulære og molekylære funktioner i neuronale sygdomsmodeller skabt af genmodifikation1, lægemiddelbehandling2 og ældning3. Den høje bevarelse af biologiske veje, fysiske egenskaber og sygdomsassocierede homologgener mellem mennesker og Drosophila gør frugtfluen til en ideel efterligning fra molekylært til adfærdsmæssigt niveau4. I mange sygdomsmodeller er adfærdsmæssig mangel et vigtigt indeks, der giver en nyttig model for forskellige humane neuropatier 5,6. Drosophila bruges nu til at studere flere menneskelige sygdomme, neuroudvikling og neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom og amyotrofisk lateral sklerose 7,8. Påvisning af sygdomsmodellernes motoriske evne er afgørende for at forstå de patogene fremskridt og kan give en fænotypisk korrelation til de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdomsprocessen.
For nylig er kommercielt tilgængelige softwareværktøjer og omkostningseffektive programmer blevet udviklet til Drosophila lokomotoriske detektionsstrategier, såsom high-throughput test i grupperede fluer9,10 og måling af bevægelse i realtid11,12. En sådan konventionel tilgang er hurtig interaktiv negativ geotaxis (RING), også kaldet klatreassayet, som inkluderer flere kanaler, der gør det muligt at indeholde en stor fluepopulation med samme køn og alder, hvilket reducerer variationen, mens dataindsamling 9,13. En anden præ-testmetode til analyse af lokomotorisk adfærd er TriKinetics Drosophila aktivitetsmonitor (DAM), en enhed, der bruger flere stråler til at detektere flueaktivitetsbevægelse i et tyndt glasrør14. Enheden registrerer position kontinuerligt, hvilket repræsenterer automatiseret bevægelse ved at beregne strålekrydsningerne for at studere fluernes aktivitet og døgnrytme over en længere periode15. Selvom disse metoder har været meget udbredt til analyse af adfærdsfejl i bananfluer for at bestemme ændringer i adfærdsmæssig bevægelse, kræver de altid specielt testudstyr eller komplekse analyseprocesser og begrænser deres anvendelse i nogle modeller med en begrænset, enkel enhed. Dyresporingsgruppebaserede strategier til test af den voksne Drosophila, såsom FlyGrAM11 og Drosophila-øanalysen 10, implementerer social rekruttering og individuel sporing i et foruddefineret område. Ikke desto mindre kan sociale individuelle begrænsninger i trodsede områder have en negativ indvirkning på identifikationer på billederne, forårsaget af kollision eller overlapning af fluer. Selvom nogle open source-materialebaserede metoder, såsom TRex16, MARGO 12 og FlyPi17, har en nødsituation, kan de hurtigt spore fluerne med fleksibel brug i adfærdstest. Disse testmetoder er forbundet med udførlige eksperimentelle apparatinstallationer, specielle softwarekrav eller professionelle computersprog. For larver er måling af den samlede tilbagelagte afstand over antallet af gittergrænselinjer pr. tidsenhed18 eller grov tælling af kropsvægskontraktionerne for individermanuelt 19 de fremherskende metoder til vurdering af deres bevægelsesevne. På grund af manglende præcision i udstyr eller enheder og analysemetoder kan nogle adfærdsmæssige bevægelser af larver undslippe detektion, hvilket gør det vanskeligt at nøjagtigt vurdere adfærdsmæssig bevægelse, især fin bevægelse15.
Den nuværende udviklede metode anvender AnimalTracker applikationsprogrammeringsgrænsefladen (API), kompatibel med Fiji (ImageJ) billedbehandlingsprogrammet, til systematisk at evaluere bevægelsesaktiviteten hos både voksne og larvefluer ved at analysere deres sporingsadfærd fra high-definition (HD) videoer. Fiji er en open source-software ImageJ-distribution, der kan kombinere robuste softwarebiblioteker med adskillige scriptsprog, hvilket resulterer i hurtig prototyping af billedbehandlingsalgoritmer, hvilket gør det populært blandt biologer for dets billedanalysefunktioner20. I den nuværende tilgang udnyttes Fijis integration i AnimalTracker API til at udvikle et unikt Drosophila-adfærdsassay med personlig algoritmeindsættelse og giver et nyttigt trin til detaljeret dokumentation og tutorials til understøttelse af robuste analytiske evner i lokomotorisk adfærd (figur 1). For at omgå komplikationen af objektive identifikationer i billederne forårsaget af kollision eller overlapning af fluer er hver arena begrænset til kun at være vært for en flue. Efter vurdering af sporingspræcisionen af tilgangen blev den implementeret for at spore og kvantificere de lokomotoriske bevægelser af Drosophila , der blev administreret med det giftige lægemiddel rotenon, som generelt bruges til dyremodeller af Parkinsons sygdom, hvilket i sidste ende opdagede bevægelsesforringelse i lægemiddelbehandlingen21. Denne metode, der anvender open source og fri software, kræver ikke dyre instrumentering, og kan præcist og reproducerbart analysere Drosophila adfærdsmæssig bevægelse.
Vi har designet en metode, baseret på open source-materialet AnimalTracker API, der er kompatibelt med Fiji-billedbehandlingsprogrammet, der kan gøre det muligt for forskere systematisk at evaluere bevægelsesaktivitet ved at spore både voksne og individuelle larvefluer. AnimalTracke er et værktøj skrevet i Java, der nemt kan integreres i eksisterende databaser eller andre værktøjer for at lette analysen af applikationsdesignet dyresporingsadfærd24. Efter en ramme-for-ram…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en særlig lanceringsfond fra Soochow University og National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). Vi takker professor Chunfeng Lius laboratoriemedlemmer for deres diskussion og kommentarer.
Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |