Настоящий протокол оценивает локомоторную активность дрозофилы путем отслеживания и анализа движения мух на самодельной арене с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом Fiji, совместимого с плагинами для сегментации пикселей каждого кадра на основе видеозаписи высокой четкости для расчета параметров скорости, расстояния и т.д.
Drosophila melanogaster является идеальным модельным организмом для изучения различных заболеваний благодаря обилию передовых методов генетических манипуляций и разнообразным поведенческим особенностям. Выявление поведенческого дефицита на животных моделях является важнейшим показателем тяжести заболевания, например, при нейродегенеративных заболеваниях, когда пациенты часто испытывают нарушения двигательной функции. Однако при наличии различных систем для отслеживания и оценки двигательного дефицита в моделях мух, таких как лекарственные препараты или трансгенные люди, по-прежнему отсутствует экономичная и удобная для пользователя система для точной оценки с разных точек зрения. Здесь разработан метод, основанный на интерфейсе прикладного программирования (API) AnimalTracker , который совместим с программой обработки изображений Фиджи, для систематической оценки двигательной активности как взрослых, так и личиночных особей по записанному видео, что позволяет анализировать их поведение при отслеживании. Этот метод требует только камеры высокой четкости и интеграции компьютерного периферийного оборудования для записи и анализа поведения, что делает его доступным и эффективным подходом для скрининга моделей мух с трансгенными или экологическими поведенческими недостатками. Приведены примеры поведенческих тестов с использованием фармакологически обработанных мух, чтобы показать, как методы могут обнаруживать поведенческие изменения как у взрослых мух, так и у личинок с высокой повторяемостью.
Drosophila melanogaster является отличным модельным организмом для исследования клеточных и молекулярных функций в моделях нейрональных заболеваний, созданных с помощью модификациигенов 1, медикаментозного лечения2 и старения3. Высокая степень сохранности биологических путей, физических свойств и генов-гомологов, связанных с заболеванием, между человеком и дрозофилой делает плодовую мушку идеальным подражателем от молекулярного до поведенческого уровня4. Во многих моделях заболеваний поведенческий дефицит является важным показателем, обеспечивающим полезную модель для различных невропатийчеловека 5,6. Дрозофила в настоящее время используется для изучения множества заболеваний человека, развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз 7,8. Обнаружение двигательной способности моделей заболевания имеет решающее значение для понимания патогенного прогресса и может обеспечить фенотипическую корреляцию с молекулярными механизмами, лежащими в основе процесса заболевания.
В последнее время были разработаны коммерчески доступные программные инструменты и экономически эффективные программы для стратегий обнаружения локомотора дрозофилы, такие как высокопроизводительные испытания на сгруппированных мухах9,10 и измерение локомоции в режиме реального времени11,12. Одним из таких традиционных подходов является быстрый интерактивный отрицательный геотаксис (RING), также называемый альпинистским анализом, который включает в себя несколько каналов, которые позволяют сдерживать большую популяцию мух того же пола и возраста, уменьшая вариации при сборе данных 9,13. Другим методом предварительного тестирования для анализа двигательного поведения является монитор активности дрозофилы TriKinetics (DAM), устройство, которое использует несколько лучей для обнаружения движения активности мух в тонкой стеклянной трубке14. Устройство непрерывно регистрирует положение, которое представляет собой автоматическую локомоцию путем вычисления пересечений лучей для изучения активности и циркадного ритма мух в течение более длительного периода времени15. Хотя эти методы широко используются при анализе поведенческих дефектов у плодовых мушек для определения изменений в поведенческой локомоции, они всегда требуют специального испытательного оборудования или сложных процессов анализа и ограничивают их применение в некоторых моделях с ограниченным, простым устройством. Групповые стратегии по отслеживанию животных для тестирования взрослых дрозофил, такие как FlyGrAM11 и анализ острова Drosophila 10, реализуют социальный набор и индивидуальное отслеживание в заранее определенной области. Тем не менее, социальные индивидуальные ограничения в неконтролируемых районах могут оказать негативное влияние на идентификацию на изображениях, вызванную столкновением или перекрытием мух. Несмотря на то, что некоторые методы, основанные на материалах с открытым исходным кодом, такие как TRex16, MARGO 12 и FlyPi17, имеют чрезвычайную ситуацию, они могут быстро отслеживать мух с гибким использованием в поведенческом тестировании. Эти подходы к тестированию связаны со сложными экспериментальными установками, специальными требованиями к программному обеспечению или профессиональными компьютерными языками. Для личинок измерение общего расстояния, пройденного по количеству пограничных линий сетки в единицу времени18, или грубый подсчет сокращений стенок тела для особей вручную19 являются преобладающими методами оценки их двигательных способностей. Из-за отсутствия точности в оборудовании или устройствах и методах анализа некоторые поведенческие локомоции личинок могут ускользнуть от обнаружения, что затрудняет точную оценку поведенческих движений, особенно тонких движений15.
В настоящем разработанном способе используется интерфейс прикладного программирования (API) AnimalTracker , совместимый с программой обработки изображений Fiji (ImageJ), для систематической оценки двигательной активности как взрослых, так и личинок мух путем анализа их поведения при отслеживании видео высокой четкости (HD). Fiji — это дистрибутив программного обеспечения ImageJ с открытым исходным кодом, который может сочетать надежные программные библиотеки с многочисленными языками сценариев, что приводит к быстрому прототипированию алгоритмов обработки изображений, что делает его популярным среди биологов благодаря своим возможностям анализа изображений20. В текущем подходе интеграция Фиджи в API AnimalTracker используется для разработки уникального поведенческого анализа дрозофилы с персонализированной вставкой алгоритма и обеспечивает полезный шаг для подробной документации и учебных пособий для поддержки надежных аналитических возможностей локомоторного поведения (рис. 1). Чтобы избежать усложнения объективной идентификации на изображениях, вызванного столкновением или перекрытием мух, каждая арена ограничена приемом только одной мухи. После оценки точности отслеживания подхода был реализован для отслеживания и количественной оценки локомоторных движений дрозофилы , которые вводили с токсичным препаратом ротеноном, который обычно используется для животных моделей болезни Паркинсона, в конечном итоге обнаружив нарушение локомоции при медикаментозном лечении21. Эта методология, использующая открытое и свободное программное обеспечение, не требует дорогостоящих инструментов и может точно и воспроизводимо анализировать поведенческую локомоцию дрозофилы .
Мы разработали метод, основанный на материалах с открытым исходным кодом AnimalTracker API, совместимых с программой обработки изображений Фиджи, который может позволить исследователям систематически оценивать двигательную активность, отслеживая как взрослых, так и отдельных личинок м?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана специальным стартовым фондом Университета Сучжоу и Национальным научным фондом Китая (NSFC) (82171414). Мы благодарим сотрудников лаборатории профессора Чуньфэн Лю за их обсуждение и комментарии.
Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |