Summary

방향족 아미노산에 의해 조절되는 세포 대사의 생체 직교 화학 이미징

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

우리는 이광자 여기 형광 현미경(2PEF)과 통합된 산화중수소(중수D2O) 탐침 자극 라만 산란(DO-SRS) 현미경을 사용하여 아미노산에 의해 조절되는 세포에서 대사 활동을 직접 시각화하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

필수 방향족 아미노산(AAA)은 세포에서 새로운 바이오매스를 합성하고 정상적인 생물학적 기능을 유지하기 위한 빌딩 블록입니다. 예를 들어, AAA의 풍부한 공급은 암세포가 빠른 성장과 분열을 유지하는 데 중요합니다. 이를 통해 세포가 현장에서 대사를 위해 AAA를 활용하는 방법을 직접 시각화하기 위해 최소한의 샘플 준비로 매우 특이적이고 비침습적인 이미징 접근 방식에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 여기에서 우리는 산화중수소(D2O) 프로빙과 유도 라만 산란(DO-SRS)을 결합하고 DO-SRS와 이광자 여기 형광(2PEF)을 단일 현미경에 통합하여 AAA 조절 하에 HeLa 세포의 대사 활동을 직접 시각화하는 광학 이미징 플랫폼을 개발합니다. 종합적으로, DO-SRS 플랫폼은 단일 HeLa 세포 단위에서 새로 합성된 단백질과 지질의 높은 공간 분해능과 특이성을 제공합니다. 또한, 2PEF 양식은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH) 및 플라빈의 자가형광 신호를 무표지 방식으로 검출할 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 시스템은 시험관 내 및 생체 내 모델 모두와 호환되며, 이는 다양한 실험에 유연합니다. 이 프로토콜의 일반적인 워크플로에는 세포 배양, 배양 배지 준비, 세포 동기화, 세포 고정, DO-SRS 및 2PEF 양식을 사용한 샘플 이미징이 포함됩니다.

Introduction

필수 방향족 아미노산인 페닐알라닌(Phe)과 트립토판(Tryp)은 인체에 흡수되어 정상적인 생물학적 기능을 유지하기 위한 새로운 분자를 합성할 수 있습니다1. Phe는 단백질, 멜라닌 및 티로신의 합성에 필요하고 Tryp은 멜라토닌, 세로토닌 및 니아신 2,3의 합성에 필요합니다. 그러나 이러한 AAA의 과도한 섭취는 포유류의 라파마이신(mTOR) 경로 표적을 상향 조절하고, AMP 활성화 단백질 키나아제를 억제하며, 미토콘드리아 대사를 방해하여 거대분자 생합성을 집합적으로 변화시키고 건강한 세포에서 활성 산소종(ROS)과 같은 악성 전구체의 생성을 유도할 수 있습니다 4,5,6. 과도한 AAA 조절 하에서 변화된 대사 역학의 직접적인 시각화는 암 발병과 건강한 세포의 성장을 촉진하는 AAA의 역할을 이해하는 데 필수적입니다 7,8,9.

전통적인 AAA 연구는 가스 크로마토그래피(GC)에 의존합니다10. 자기공명영상(MRI)과 같은 다른 방법들은 제한된 공간 분해능을 가지며, 이는 생물학적 샘플의 세포 및 준세포 분석을 수행하기 어렵게 만든다11. 최근에, 비침습적 바이오마커12,13,14를 사용하여 암 증식에서 지질 및 단백질 합성에서 AAA의 역할을 설명하기 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)가 개발되었습니다. 그러나 이 기술은 여전히 얕은 이미징 깊이, 열악한 공간 해상도 및 광범위한 샘플 준비로 어려움을 겪고 있습니다. 세포 수준에서 질소-15 및 탄소-13과 같은 무독성 안정 동위원소는 다중 동위원소 이미징 및 나노 스케일 2차 이온 질량 분석법으로 추적하여 거대분자로의 결합을 이해할 수 있습니다. 그러나, 이들 방법은 살아있는 생물학적 샘플(15,16)을 파괴한다. 원자력 현미경(Atomic force microscopy, AFM)은 대사 역학을 시각화할 수 있는 또 다른 강력한 기술이다17. 반면에 AFM 이미징 중 스캔 속도가 느리면 열 드리프트로 인한 이미지 왜곡이 발생할 수 있습니다.

우리는 중수소-산화물(D2O) 프로브 자극 라만 산란(DO-SRS) 현미경 및 무표지 이광자 여기 형광 현미경(2PEF)을 결합하여 비침습적 쌍직교 이미징 방식을 개발했습니다. 이 양식은 생물학적 샘플 18,19,20,21,22,23,24를 이미징 할 때 높은 공간 분해능 및 화학적 특이성을 달성합니다. 이 프로토콜은 암 진행 중 지질, 단백질 및 산화 환원 비율 변화의 대사 역학을 조사하기 위해 DO-SRS 및 2PEF의 응용 프로그램을 소개합니다. D2O가 안정한 동위원소 형태의 물이기 때문에, 세포 내 총 체수분으로 빠르게 보상되어 효소 교환을 통해 탄소-중수소(C-D) 결합을 형성하기 때문에 세포 생체 분자를 중수소(D)로 표지할 수 있습니다21. 지질, 단백질, DNA/RNA 및 탄수화물을 포함하여 새로 합성된 거대분자의 C-D 결합은 라만 스펙트럼20,21,22,25,26,27의 세포 침묵 영역에서 검출될 수 있습니다. 두 개의 동기화된 레이저 펄스를 사용하면 새로 합성된 지질과 단백질의 C-D 결합을 추출하거나 세포독성제로 표지하지 않고도 초분광 이미징(HSI)을 통해 단일 세포에 표시할 수 있습니다. 또한, SRS 현미경은 일련의 단면 이미지(22,26)를 캡처하고 조합함으로써 생물학적 샘플에서 선택된 관심 영역의 3차원(3D) 모델을 구성할 수 있는 능력을 갖는다. 초분광 및 3D 체적 이미징을 통해 DO-SRS는 AAA 규정22에 따라 암 성장을 촉진하는 과정을 촉진하는 세포 기관 유형과 함께 단일 세포에서 새로 합성된 거대분자의 공간 분포를 얻을 수 있습니다. 또한, 2PEF를 사용하여, 우리는 생물학적 샘플21,23,24에서 고해상도, 깊은 침투 깊이 및 낮은 수준의 손상을 갖는 플라빈 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)의 자가형광 신호를 얻을 수 있습니다. Flavin 및 NADH 자가형광 신호는 암세포에서 산화환원 항상성 및 지질 과산화를 특성화하는 데 사용되었습니다22,26. 따라서 DO-SRS와 2PEF의 결합은 높은 공간 분포, 화학적 특이성 정보 및 최소한의 샘플 준비로 암세포에서 AAA 조절 대사 역학의 세포 내 분석을 제공할 뿐만 아니라 이 방법은 독성 시약으로 내인성 분자를 추출하거나 라벨링할 필요성을 줄여줍니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 D2O 및 아미노산 준비뿐만 아니라 암 세포 배양의 절차를 제시합니다. 그런 다음 DO-SRS 이미징 및 2PEF 이미징의 프로토콜을 보여줍니다. 마지막으로 지질과 단백질의 AAA 조절 대사 변화와 암세포의 산화환원 비율 변화를 보여주는 SRS 및 2PEF 이미징의 대표적인 결과를 제시합니다. 프로세스에 대한 자세한 그림은 그림 1에 강조 표시되어 있습니다.

Protocol

1. 매체 준비 50O를 함유하는 Dulbecco’s modified Eagle 배지(DMEM)에서 10mL의 대조군 및 과잉 AAA를 준비합니다.대조군 배지의 경우, 15 mL 코니컬 튜브에서 10 mg의 DMEM 분말과 4.7 mL의 이중 증류수(ddH2O)를 측정하고 혼합한다. DMEM 분말은 표준 농도의 모든 아미노산을 함유하고 있습니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 4.7mL의 D2O</su…

Representative Results

50O-함유 세포 배양 배지에 15x 농도의 과량의 AAA를 첨가하면 HeLa 세포에서 새로 합성된 지질 및 단백질의 뚜렷한 C-D 라만 밴드가 생성되었습니다(그림 2B). 이전 실험은 2x 및 5x와 같은 다양한 농도 수준으로 수행되었으며 데이터가 제시되지는 않았지만 15x 농도는 새로 합성된 지질 및 단백질의 가장 뚜렷한 C-D 라만 밴드를 생성했습니다. 구체적으로, 지질 방울(LD)을 …

Discussion

DO-SRS 및 2PEF 이미징은 초파리 및 인간 조직 21,22,23,24,26,27,33을 포함한 다양한 생체 외 모델에서 대사 역학을 조사하기 위해 적용되었습니다. 이 연구에 사용된 이미징 양식은 DO-SRS 및 2PEF 현미경을 통합하여 분자 추?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

기술 지원을 해주신 Yajuan Li 박사와 Anthony Fung, 세포주에 대해 Fraley 연구실에 감사드립니다. 우리는 UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 및 Hellman Fellow Award의 창업 자금을 인정합니다.

Materials

10 mL Serological Pipettes  Avantor (by VWR) 75816-100 https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge Tube VWR 89039-664 https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-free ThermoFisher Scientific 28906 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plate Fisherbrand FB0112929 https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PES Foxx Life Sciences 381-2216-OEM https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter Cube Olympus OCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote Olympus Supply power to the laser
Band-pass Filter KR Electronics KR2724 8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator  Mini Circuits STRM-50
BNC Cable Thorlabs 2249-C Coaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric Mirror Thorlabs BB1-E03 750 – 1100 nm
Centrifuge
Condenser Olympus
Cover Glass Corning 2850-25 https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supply TopWard 6302D
Dichroic Mount Thorlabs KM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent mpbio  196055 https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate MilliporeSigma 38210000 https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Corning MT10027CV https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJ ImageJ Version 1.53t 24 August 2022 https://imagej.net/software/fiji/downloads
Heavy Water (Deuterium Oxide) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. 7732-18-5 https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela Cells ATCC CCL-2 https://www.atcc.org/products/ccl-2
Hemocymeter MilliporeSigma Z359629-1EA https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass Filter Chroma Technology ET890/220m Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva  SH300880340 https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution Cytiva SH30042.02 https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser System Applied Physics & Electronics, Inc. picoEMERALD picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning Microscope Olympus FV1200MPE
IX3-CBH Control box Olympus Control the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror Mount Thorlabs POLARIS-K1-2AH 2 Low-Profile Hex Adjusters
L-Phenalynine Sigma P5482-25G https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-Tryptophan Sigma T8941-25G https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6 Horiba XploRA N/A https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In Amplifier Zurich Instruments N/A https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam Splitter Semrock Di02-R980-25×36 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLAB MathWorks Version: R2022b https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-003 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging Software Olympus FluoView
MPLN 100x, Olympus Olympus MPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, Olympus Olympus MPLAPON  https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil Condenser Olympus  6-U130 https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail Polish Wet n Wild B01EO2G5O4 https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
Origin OriginLab Origin 2022b (9.95) https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
Parafilm Fisher Scientific S37440 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Thermofischer – Gibco 14040117 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/Streptomycin Thermofischer – Gibco 15140122 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope Assembly Thorlabs RS99 Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald System A.P.E N/A https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC Connectors Pomona Electronics 2902 Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode Detector Home Built N/A DYI series
Silicon Wafer
Spacers Grace Bio-Labs 654008 https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopy Horiba XploRA N/A https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering Microscopy Home Built N/A
Touch  Panel Controller Olympus Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl)  Lonza 17-942E https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
Tweezers Kaverme – Amazon B07RNVXXV1 https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy Home Built N/A
Weighing Paper  VWR 12578-165 https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich LabOneQ Software Zurich Instruments Control the Zurich lock-in amplifier

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Bagheri, P., Hoang, K., Kuo, C., Trivedi, H., Jang, H., Shi, L. Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids. J. Vis. Exp. (195), e65121, doi:10.3791/65121 (2023).

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