Summary

Standardisering af et cytometrisk perleassay baseret på æggeblommeantistoffer

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af latexperler til assays ved anvendelse af IgY-antistoffer til antigendetektion.

Abstract

Immunoassays er vigtige tests til påvisning af adskillige molekylære mål. Blandt de metoder, der i øjeblikket er tilgængelige, har det cytometriske perleassay fået fremtrædende plads i de seneste årtier. Hver mikrosfære, der læses af udstyret, repræsenterer en analysehændelse af interaktionskapaciteten mellem molekylerne under test. Tusindvis af disse hændelser læses i et enkelt assay, hvilket sikrer høj analysenøjagtighed og reproducerbarhed. Denne metode kan også anvendes til validering af nye input, såsom IgY-antistoffer, til diagnosticering af sygdomme. Disse antistoffer opnås ved immunisering af kyllinger med antigenet af interesse og derefter ekstrahering af immunoglobulin fra æggeblommen af dyrenes æg; Derfor er dette en smertefri og yderst produktiv metode til opnåelse af antistofferne. Ud over en metode til højpræcisionsvalidering af antistofgenkendelseskapaciteten i dette assay præsenterer dette papir også en metode til ekstraktion af disse antistoffer, bestemmelse af de bedste koblingsbetingelser for antistoffer og latexperler og bestemmelse af testens følsomhed.

Introduction

Blandt immunoassayteknikkerne til diagnosticering af sygdomme har det cytometriske perleassay vist sig som en meget følsom og pålidelig tilgang, da det muliggør analyse af tusindvis af partikler i et enkelt assay1. Denne teknik ud over at have høj produktivitet og tillade anvendelse af mindre mængder prøver giver også stor fleksibilitet, da den muliggør påvisning af flere molekyler, såsom cytokiner, vedhæftningsmolekyler, antistofisotyper og proteiner 2,3.

Forskellige partikler anvendes til udvikling af disse analyser, blandt dem latexperler, som er et effektivt og billigt input. Disse kan præsentere ændringer på deres overflade, såsom tilstedeværelsen af funktionelle grupper eller proteiner, der tillader kovalent eller ikke-kovalent kobling af visse molekyler 3,4,5.

Disse immunoassays bruger komponenter såsom antigener og antistoffer til at udføre påvisning af sygdomsmarkører og kræver almindeligvis antistoffer fra pattedyr som mus, kaniner og geder. Dette skaber problemer relateret til etiske spørgsmål, da immunisering af pattedyr generelt kræver, at mange dyr opnår et godt udbytte, samt den hyppige udførelse af procedurer, der fører til dyrenes lidelse 6,7. Et alternativ til dette er brugen af IgY-antistoffer isoleret fra æggeblommer fra immuniserede kyllinger, da høje koncentrationer af de specifikke antistoffer mod de inokulerede antigener kan findes i æggeblommerne; Produktionen af en kylling svarer til produktionen af 4,3 kaniner i løbet af et år 6,7.

Formålet med denne protokol er således at tilvejebringe en metode til evaluering af IgY-antistoffer opnået fra kyllingæggeblommer under anvendelse af flowcytometri med latexperler. Til dette foreslår vi en standardiseringsmetode til et cytometrisk perleimmunoassay i sandwichformat ved hjælp af latexperler. Som model brugte vi IgY-antistoffer rettet mod Plasmodium falciparum histidin-rige protein II-antigen (IgY-PfHRP2). Vi beskriver en metode til ekstraktion af antistofferne, diskuterer de kritiske trin til definition af koblingskoncentrationen af disse til latexperlerne og præsenterer en evaluering af grænsen for detektion af antigenet. Den høje nøjagtighed af flowcytometri kombineret med de lave omkostninger ved latexperler gør denne teknik anvendelig til analyse af immunoassayværktøjer, såsom antistoffer og antigener. Denne metode kan bruges til påvisning af forskellige mål.

Protocol

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og instrumenter, der anvendes i denne protokol. 1. Ekstraktion af IgY fra æggeblommer Hygiejne af æggeneDyp æggene (frisklagt eller indtil 4 dage efter lagt, fra Gallus gallus Dekalb White slægten) i en 0,2% fortyndet opløsning af natriumhypochlorit, skyl hurtigt under rindende vand og tør forsigtigt til senere eller øjeblikkelig brug.BEMÆRK…

Representative Results

Figur 2 giver en grafisk repræsentation af ekstraktionsprocessen af IgY-antistoffer via forsuring efterfulgt af separation ved hjælp af caprylsyre (figur 2). Figur 2: Skematisk gengivelse af ekstraktionstrinnet af IgY-antistoffer og separation under anvendelse …

Discussion

Metoden til udfældning af IgY-antistoffet ved pH-reduktion efterfulgt af lipidseparation under anvendelse af caprylsyre er effektiv til isolering af totale antistoffer uden tab af funktionalitet. Den metode, der foreslås her, er enklere og billigere end den, der er rapporteret af Redwan et al.11, som også anvendte udfældning ved forsuring og caprylsyre, men med en mere kompleks og besværlig protokol. Denne metode giver også fordele i forhold til almindeligt anvendte metoder til IgY-isolering…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke FIOCRUZ (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD / Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS / ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), Postgraduate-programmet i bioteknologi (PPGBIOTEC ved Universidade Federal do Amazonas – UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) for at yde stipendierne. Figur 2 og figur 4 blev oprettet med biorender.com.

Materials

Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey Sigma-Aldrich SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Sigma-Aldrich SAB4600388
BD FACSCanto II BD Biosciences BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) BD Biosciences 655050
BD FACSDiva software 7.0 BD Biosciences 655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Caprilic acid Sigma-Aldrich O3907
Centrifuge 5702 R Eppendorf Z606936
Chloride 37% acid molecular grade NEON 02618 NEON
CML latex, 4% w/v Invitrogen C37253
Megafuge 8R Thermo Scientific TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) Sigma-Aldrich E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672-25G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich 1003335620
Sodium hydroxide Acs Cientifica P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite Acs Cientifica R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool KASVI K80-120R

References

  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

Play Video

Cite This Article
Corrêa Glória, J., Oliveira Chaves, Y., Marques de Figueiredo, A., Coutinho de Souza, C., Duarte da Silva, E. R., Lopes Batista, J. C., Nogueira, P. A., Morais Mariúba, L. A. Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies. J. Vis. Exp. (195), e65123, doi:10.3791/65123 (2023).

View Video