Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af latexperler til assays ved anvendelse af IgY-antistoffer til antigendetektion.
Immunoassays er vigtige tests til påvisning af adskillige molekylære mål. Blandt de metoder, der i øjeblikket er tilgængelige, har det cytometriske perleassay fået fremtrædende plads i de seneste årtier. Hver mikrosfære, der læses af udstyret, repræsenterer en analysehændelse af interaktionskapaciteten mellem molekylerne under test. Tusindvis af disse hændelser læses i et enkelt assay, hvilket sikrer høj analysenøjagtighed og reproducerbarhed. Denne metode kan også anvendes til validering af nye input, såsom IgY-antistoffer, til diagnosticering af sygdomme. Disse antistoffer opnås ved immunisering af kyllinger med antigenet af interesse og derefter ekstrahering af immunoglobulin fra æggeblommen af dyrenes æg; Derfor er dette en smertefri og yderst produktiv metode til opnåelse af antistofferne. Ud over en metode til højpræcisionsvalidering af antistofgenkendelseskapaciteten i dette assay præsenterer dette papir også en metode til ekstraktion af disse antistoffer, bestemmelse af de bedste koblingsbetingelser for antistoffer og latexperler og bestemmelse af testens følsomhed.
Blandt immunoassayteknikkerne til diagnosticering af sygdomme har det cytometriske perleassay vist sig som en meget følsom og pålidelig tilgang, da det muliggør analyse af tusindvis af partikler i et enkelt assay1. Denne teknik ud over at have høj produktivitet og tillade anvendelse af mindre mængder prøver giver også stor fleksibilitet, da den muliggør påvisning af flere molekyler, såsom cytokiner, vedhæftningsmolekyler, antistofisotyper og proteiner 2,3.
Forskellige partikler anvendes til udvikling af disse analyser, blandt dem latexperler, som er et effektivt og billigt input. Disse kan præsentere ændringer på deres overflade, såsom tilstedeværelsen af funktionelle grupper eller proteiner, der tillader kovalent eller ikke-kovalent kobling af visse molekyler 3,4,5.
Disse immunoassays bruger komponenter såsom antigener og antistoffer til at udføre påvisning af sygdomsmarkører og kræver almindeligvis antistoffer fra pattedyr som mus, kaniner og geder. Dette skaber problemer relateret til etiske spørgsmål, da immunisering af pattedyr generelt kræver, at mange dyr opnår et godt udbytte, samt den hyppige udførelse af procedurer, der fører til dyrenes lidelse 6,7. Et alternativ til dette er brugen af IgY-antistoffer isoleret fra æggeblommer fra immuniserede kyllinger, da høje koncentrationer af de specifikke antistoffer mod de inokulerede antigener kan findes i æggeblommerne; Produktionen af en kylling svarer til produktionen af 4,3 kaniner i løbet af et år 6,7.
Formålet med denne protokol er således at tilvejebringe en metode til evaluering af IgY-antistoffer opnået fra kyllingæggeblommer under anvendelse af flowcytometri med latexperler. Til dette foreslår vi en standardiseringsmetode til et cytometrisk perleimmunoassay i sandwichformat ved hjælp af latexperler. Som model brugte vi IgY-antistoffer rettet mod Plasmodium falciparum histidin-rige protein II-antigen (IgY-PfHRP2). Vi beskriver en metode til ekstraktion af antistofferne, diskuterer de kritiske trin til definition af koblingskoncentrationen af disse til latexperlerne og præsenterer en evaluering af grænsen for detektion af antigenet. Den høje nøjagtighed af flowcytometri kombineret med de lave omkostninger ved latexperler gør denne teknik anvendelig til analyse af immunoassayværktøjer, såsom antistoffer og antigener. Denne metode kan bruges til påvisning af forskellige mål.
Metoden til udfældning af IgY-antistoffet ved pH-reduktion efterfulgt af lipidseparation under anvendelse af caprylsyre er effektiv til isolering af totale antistoffer uden tab af funktionalitet. Den metode, der foreslås her, er enklere og billigere end den, der er rapporteret af Redwan et al.11, som også anvendte udfældning ved forsuring og caprylsyre, men med en mere kompleks og besværlig protokol. Denne metode giver også fordele i forhold til almindeligt anvendte metoder til IgY-isolering…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke FIOCRUZ (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD / Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS / ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), Postgraduate-programmet i bioteknologi (PPGBIOTEC ved Universidade Federal do Amazonas – UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) for at yde stipendierne. Figur 2 og figur 4 blev oprettet med biorender.com.
Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |