В данной статье демонстрируется стандартизированный метод построения трехмерных опухолевых сфероидов. Также описана стратегия наблюдения сфероидов и анализа глубокого обучения на основе изображений с использованием автоматизированной системы визуализации.
В последние десятилетия, в дополнение к клеткам, культивируемым монослоями, были разработаны трехмерные опухолевые сфероиды в качестве потенциально мощного инструмента для оценки противоопухолевых препаратов. Тем не менее, традиционные методы культивирования не имеют возможности манипулировать опухолевыми сфероидами гомогенным образом на трехмерном уровне. Чтобы устранить это ограничение, в этой статье мы представляем удобный и эффективный метод построения опухолевых сфероидов среднего размера. Кроме того, мы описываем метод анализа на основе изображений с использованием программного обеспечения для анализа на основе искусственного интеллекта, которое может сканировать всю пластину и получать данные о трехмерных сфероидах. Было изучено несколько параметров. Используя стандартный метод построения опухолевого сфероида и высокопроизводительную систему визуализации и анализа, эффективность и точность тестов на лекарства, выполняемых на трехмерных сфероидах, могут быть значительно увеличены.
Рак является одним из заболеваний, которых больше всего боятся люди, не в последнюю очередь из-за высокого уровня смертности1. В последние годы возможности лечения рака увеличились, поскольку были введены новые методы лечения 2,3,4,5. Двумерные (2D) и трехмерные (3D) модели in vitro используются для изучения рака в лабораторных условиях. Однако 2D-модели не могут сразу и точно оценить все важные параметры, указывающие на противоопухолевую чувствительность; следовательно, они не могут полностью представить взаимодействия in vivo при тестировании лекарственной терапии6.
С 2020 года мировой рынок трехмерной (3D) культуры значительно вырос. Согласно одному отчету NASDAQ OMX, к концу 2025 года мировая стоимость рынка 3D-клеточных культур превысит 2,7 миллиарда долларов США. По сравнению с методами 2D-культивирования, 3D-культивирование клеток обладает преимущественными свойствами, которые могут быть оптимизированы не только для пролиферации и дифференцировки, но и для долгосрочной выживаемости 7,8. Таким образом, клеточные микроокружения in vivo могут быть смоделированы для получения более точной характеристики опухоли, а также метаболического профилирования, чтобы можно было лучше понять геномные и белковые изменения. В связи с этим 3D-тест-системы теперь должны быть включены в основные операции по разработке лекарств, особенно те, которые сосредоточены на скрининге и оценке новых противоопухолевых препаратов. Трехмерные наросты иммортализированных установленных клеточных линий или первичных клеточных культур в сфероидных структурах обладают свойствами in vivo опухолей, такими как гипоксия и проникновение лекарств, а также клеточное взаимодействие, реакция и резистентность, и могут рассматриваться как строгая и репрезентативная модель для проведения скрининга лекарств in vitro 9,10,11.
Однако эти модели 3D-культуры также страдают от нескольких проблем, для решения которых может потребоваться некоторое время. Клеточные сфероиды могут быть сформированы с использованием этих протоколов, но они различаются в некоторых деталях, таких как время культивирования или встраивание гелей12, поэтому эти сконструированные клеточные сфероиды не могут хорошо контролироваться в ограниченном диапазоне размеров. Размер сфероидов может влиять на согласованность теста на жизнеспособность и анализа изображений. Микроокружение роста и факторы роста также варьируются, что может привести к различным морфологиям из-за различий в дифференцировке между клетками13. В настоящее время существует очевидная потребность в стандартном, простом и экономически эффективном методе построения всех типов опухолей с контролируемыми размерами.
С другой стороны, несмотря на то, что для оценки морфологии, жизнеспособности и скорости роста были разработаны однородные анализы и подходы к визуализации с высоким содержанием, высокопроизводительный скрининг 3D-моделей остается проблемой по различным причинам, о которых сообщается в литературе, таким как отсутствие единообразия в положении, размере и морфологии опухолевых сфероидов14,15,16.
В представленном здесь протоколе мы перечисляем каждый шаг в построении 3D-опухолевых сфероидов и описываем метод наблюдения и анализа сфероидов с использованием высокопроизводительной системы визуализации с высоким содержанием, которая включает автофокусировку, автовизуализацию и анализ, а также другие полезные характеристики. Мы показываем, как этот метод может производить 3D-опухолевые сфероиды одинакового размера, которые подходят для высокопроизводительной визуализации. Эти сфероиды также демонстрируют высокую чувствительность к медикаментозному лечению рака, и морфологические изменения в сфероидах можно контролировать с помощью визуализации с высоким содержанием. Таким образом, мы демонстрируем надежность этой методологии как средства создания 3D-опухолевых конструкций для целей оценки лекарств.
Микроокружение играет важную роль в росте опухоли. Он может влиять на обеспечение внеклеточных матриц, градиенты кислорода, питание и механическое взаимодействие и, таким образом, влиять на экспрессию генов, сигнальные пути и многие функции опухолевых клеток 19,20,21.<sup…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим всех сотрудников наших лабораторий за их критический вклад и предложения. Это исследование было поддержано ключевым проектом Комиссии по здравоохранению провинции Цзянсу (K2019030). Концептуализация была проведена C.W. и Z.C., методология была выполнена W.H. и M.L., исследование было выполнено W.H. и M.L., курирование данных было выполнено W.H., Z.Z., S.X. и M.L., первоначальная подготовка проекта была выполнена Z.Z., J.Z., S.X., W.H., и X.L., обзор и редактирование были выполнены З.К., управление проектом осуществлялось К.В. и З.К., а привлечение финансирования осуществлялось К.В. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.
0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
3D gel | Avatarget | MA02 | |
48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
DMSO | sigma | D2650-100ML | |
Excel sofware | Microsoft office | ||
Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
Image J software | National Institutes of Health | ||
Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
PBS | Solarbio | P1020 | |
Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |