Summary

Генерация 3D-опухолевых сфероидов для исследований по оценке лекарственных средств

Published: February 24, 2023
doi:

Summary

В данной статье демонстрируется стандартизированный метод построения трехмерных опухолевых сфероидов. Также описана стратегия наблюдения сфероидов и анализа глубокого обучения на основе изображений с использованием автоматизированной системы визуализации.

Abstract

В последние десятилетия, в дополнение к клеткам, культивируемым монослоями, были разработаны трехмерные опухолевые сфероиды в качестве потенциально мощного инструмента для оценки противоопухолевых препаратов. Тем не менее, традиционные методы культивирования не имеют возможности манипулировать опухолевыми сфероидами гомогенным образом на трехмерном уровне. Чтобы устранить это ограничение, в этой статье мы представляем удобный и эффективный метод построения опухолевых сфероидов среднего размера. Кроме того, мы описываем метод анализа на основе изображений с использованием программного обеспечения для анализа на основе искусственного интеллекта, которое может сканировать всю пластину и получать данные о трехмерных сфероидах. Было изучено несколько параметров. Используя стандартный метод построения опухолевого сфероида и высокопроизводительную систему визуализации и анализа, эффективность и точность тестов на лекарства, выполняемых на трехмерных сфероидах, могут быть значительно увеличены.

Introduction

Рак является одним из заболеваний, которых больше всего боятся люди, не в последнюю очередь из-за высокого уровня смертности1. В последние годы возможности лечения рака увеличились, поскольку были введены новые методы лечения 2,3,4,5. Двумерные (2D) и трехмерные (3D) модели in vitro используются для изучения рака в лабораторных условиях. Однако 2D-модели не могут сразу и точно оценить все важные параметры, указывающие на противоопухолевую чувствительность; следовательно, они не могут полностью представить взаимодействия in vivo при тестировании лекарственной терапии6.

С 2020 года мировой рынок трехмерной (3D) культуры значительно вырос. Согласно одному отчету NASDAQ OMX, к концу 2025 года мировая стоимость рынка 3D-клеточных культур превысит 2,7 миллиарда долларов США. По сравнению с методами 2D-культивирования, 3D-культивирование клеток обладает преимущественными свойствами, которые могут быть оптимизированы не только для пролиферации и дифференцировки, но и для долгосрочной выживаемости 7,8. Таким образом, клеточные микроокружения in vivo могут быть смоделированы для получения более точной характеристики опухоли, а также метаболического профилирования, чтобы можно было лучше понять геномные и белковые изменения. В связи с этим 3D-тест-системы теперь должны быть включены в основные операции по разработке лекарств, особенно те, которые сосредоточены на скрининге и оценке новых противоопухолевых препаратов. Трехмерные наросты иммортализированных установленных клеточных линий или первичных клеточных культур в сфероидных структурах обладают свойствами in vivo опухолей, такими как гипоксия и проникновение лекарств, а также клеточное взаимодействие, реакция и резистентность, и могут рассматриваться как строгая и репрезентативная модель для проведения скрининга лекарств in vitro 9,10,11.

Однако эти модели 3D-культуры также страдают от нескольких проблем, для решения которых может потребоваться некоторое время. Клеточные сфероиды могут быть сформированы с использованием этих протоколов, но они различаются в некоторых деталях, таких как время культивирования или встраивание гелей12, поэтому эти сконструированные клеточные сфероиды не могут хорошо контролироваться в ограниченном диапазоне размеров. Размер сфероидов может влиять на согласованность теста на жизнеспособность и анализа изображений. Микроокружение роста и факторы роста также варьируются, что может привести к различным морфологиям из-за различий в дифференцировке между клетками13. В настоящее время существует очевидная потребность в стандартном, простом и экономически эффективном методе построения всех типов опухолей с контролируемыми размерами.

С другой стороны, несмотря на то, что для оценки морфологии, жизнеспособности и скорости роста были разработаны однородные анализы и подходы к визуализации с высоким содержанием, высокопроизводительный скрининг 3D-моделей остается проблемой по различным причинам, о которых сообщается в литературе, таким как отсутствие единообразия в положении, размере и морфологии опухолевых сфероидов14,15,16.

В представленном здесь протоколе мы перечисляем каждый шаг в построении 3D-опухолевых сфероидов и описываем метод наблюдения и анализа сфероидов с использованием высокопроизводительной системы визуализации с высоким содержанием, которая включает автофокусировку, автовизуализацию и анализ, а также другие полезные характеристики. Мы показываем, как этот метод может производить 3D-опухолевые сфероиды одинакового размера, которые подходят для высокопроизводительной визуализации. Эти сфероиды также демонстрируют высокую чувствительность к медикаментозному лечению рака, и морфологические изменения в сфероидах можно контролировать с помощью визуализации с высоким содержанием. Таким образом, мы демонстрируем надежность этой методологии как средства создания 3D-опухолевых конструкций для целей оценки лекарств.

Protocol

1. Конструкция сфероида Антиадгезионная обработка культуральной пластиныПипетку 100 мкл антиадгезионного реагента в каждую лунку 48-луночной пластины с U-образным дном колодца и держать в течение 10 мин. Через 10 минут аспирируйте реагент для покрытия и дважды промойте с…

Representative Results

На рисунке 1A, B показан процесс, используемый для построения опухолевых сфероидов в этом исследовании. Сначала мы засеяли клетки в 48-луночную U-образную нижнюю пластину. Этот шаг почти такой же, как и в 2D-культуре клеток. Мы держали пластину в общем инкубаторе с во…

Discussion

Микроокружение играет важную роль в росте опухоли. Он может влиять на обеспечение внеклеточных матриц, градиенты кислорода, питание и механическое взаимодействие и, таким образом, влиять на экспрессию генов, сигнальные пути и многие функции опухолевых клеток 19,20,21.<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим всех сотрудников наших лабораторий за их критический вклад и предложения. Это исследование было поддержано ключевым проектом Комиссии по здравоохранению провинции Цзянсу (K2019030). Концептуализация была проведена C.W. и Z.C., методология была выполнена W.H. и M.L., исследование было выполнено W.H. и M.L., курирование данных было выполнено W.H., Z.Z., S.X. и M.L., первоначальная подготовка проекта была выполнена Z.Z., J.Z., S.X., W.H., и X.L., обзор и редактирование были выполнены З.К., управление проектом осуществлялось К.В. и З.К., а привлечение финансирования осуществлялось К.В. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Materials

0.5-10 μL Pipette tips AXYGEN T-300
1.5 mL Boil proof microtubes Axygen MCT-150-C
100-1000μL Pipette tips KIRGEN KG1313
15 mL Centrifuge Tube Nest 601052
200 μL Pipette tips AXYGEN T-200-Y
3D gel Avatarget MA02
48-well U bottom Plate Avatarget P02-48UWP
50 mL Centrifuge Tube Nest 602052
Alamar Blue Thermo  DAL1100
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL #07010
Certified FBS BI 04-001-1ACS
Deionized water aladdin W433884-500ml
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Gibco 11965-092
DMSO sigma D2650-100ML
Excel sofware  Microsoft office
Graphpad prism sofware  GraphPad software 
High Content Microscope and SMART system Avatarget 1-I01
Image J software National Institutes of Health
Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) Gibco 51300-044
Parafilm Bemis PM-996
PBS Solarbio P1020
Penicillin/streptomycin Sol Gibco 15140-122
RPMI 1640 Gibco 11875-093
Scientific Fluoroskan Ascent Thermo Fluoroskan Ascent
T25 Flask JET Biofil TCF012050
Trypsin, 0.25% (1X) Hyclone SH30042.01

References

  1. Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
  2. Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
  3. Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
  4. Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
  5. Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
  6. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  8. Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
  9. Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
  10. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).
  11. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  12. Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
  13. Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
  14. Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  15. Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
  16. Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
  17. Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
  18. Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
  19. Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
  20. Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
  21. Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
  22. Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
  23. Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
  24. Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
  25. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  26. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
  27. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).

Play Video

Cite This Article
Hou, W., Zhang, Z., Zhang, J., Xu, S., Li, M., Li, X., Chen, Z., Wang, C. Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies. J. Vis. Exp. (192), e65125, doi:10.3791/65125 (2023).

View Video