Utilizzo della nicotina in un modello murino esposto alla silice per promuovere la transizione epitelio-mesenchimale polmonare
Summary
Questo studio descrive un modello murino per studiare l’effetto sinergico della nicotina sulla progressione della fibrosi polmonare nei topi sperimentali affetti da silicosi. Il modello murino a doppia esposizione simula la progressione patologica nel polmone dopo l’esposizione simultanea a nicotina e silice. I metodi descritti sono semplici e altamente riproducibili.
Abstract
Il fumo e l’esposizione alla silice sono comuni tra i lavoratori e la silice ha maggiori probabilità di danneggiare i polmoni dei fumatori rispetto ai non fumatori. Il ruolo della nicotina, il principale ingrediente che crea dipendenza nelle sigarette, nello sviluppo della silicosi non è chiaro. Il modello murino impiegato in questo studio era semplice e facilmente controllabile, e simulava efficacemente gli effetti dell’ingestione cronica di nicotina e dell’esposizione ripetuta alla silice sulla fibrosi polmonare attraverso la transizione epiteliale-mesenchimale negli esseri umani. Inoltre, questo modello può aiutare nello studio diretto degli effetti della nicotina sulla silicosi, evitando gli effetti di altri componenti nel fumo di sigaretta.
Dopo l’adattamento ambientale, i topi sono stati iniettati per via sottocutanea con 0,25 mg/kg di soluzione di nicotina nella pelle flaccida sopra il collo ogni mattina e sera a intervalli di 12 ore per 40 giorni. Inoltre, la polvere di silice cristallina (1-5 μm) è stata sospesa in soluzione fisiologica normale, diluita in una sospensione di 20 mg/mL e dispersa uniformemente utilizzando un bagno d’acqua ad ultrasuoni. I topi anestetizzati con isoflurano hanno inalato 50 μL di questa sospensione di polvere di silice attraverso il naso e sono stati svegliati tramite massaggio toracico. L’esposizione alla silice è stata somministrata quotidianamente nei giorni 5-19.
Il modello murino a doppia esposizione è stato esposto alla nicotina e poi alla silice, che corrisponde alla storia di esposizione dei lavoratori esposti a entrambi i fattori nocivi. Inoltre, la nicotina ha promosso la fibrosi polmonare attraverso la trasformazione epiteliale-mesenchimale (EMT) nei topi. Questo modello animale può essere utilizzato per studiare gli effetti di molteplici fattori sullo sviluppo della silicosi.
Introduction
L’esposizione alla silice nei lavoratori è inevitabile in alcuni ambienti di lavoro e, una volta esposti alla silice, il deterioramento progredisce anche dopo la rimozione dall’ambiente. Inoltre, la maggior parte di questi lavoratori fuma e le sigarette tradizionali contengono migliaia di sostanze chimiche, con il componente chiave che crea dipendenza essendo la nicotina1. Le sigarette elettroniche stanno diventando sempre più popolari nelle fasce di età più giovani2; Queste sigarette elettroniche agiscono come un sistema di somministrazione di nicotina e aumentano l’accesso alla nicotina, aumentando così la suscettibilità polmonare e la polmonite3. Il fumo di sigaretta accelera anche la fibrosi polmonare nei topi esposti alla bleomicina4 e aumenta la tossicità polmonare e la fibrosi nei topi esposti alla silice 5,6. Tuttavia, resta da indagare se la nicotina possa influenzare il processo di fibrosi infiammatoria e polmonare causato dalla silice.
Il modello murino di silicosi stabilito dall’inalazione una tantum di un’alta dose di silice nella trachea è traumatico per i topi. Sebbene questo metodo fornisca rapidamente un modello di silicosi, non corrisponde alla realtà di un ambiente in cui i lavoratori sono ripetutamente esposti alla silice. Pertanto, abbiamo stabilito un modello murino esposto alla silice somministrando ripetutamente una bassa dose di sospensioni di silice tramite una flebo nasale; Questa dose può causare infiammazione e fibrosi nei topi.
Per aggirare gli effetti di altri componenti della sigaretta, questo modello murino è stato iniettato per via sottocutanea con nicotina nella pelle flaccida del collo per determinare l’effetto del componente che crea dipendenza, la nicotina, sulla silicosi. Somministrando iniezioni sottocutanee, è possibile ottenere un dosaggio accurato, rendendo così possibile la creazione di modelli di esposizione alla nicotina e l’osservazione delle risposte dose-tossicità, nonché della dipendenza. Un modello di dipendenza da nicotina è stato sviluppato in topi maschi, con una dose iniettata di nicotina di 0,2-0,4 mg/kg 7,8. In quel modello, per soddisfare le esigenze di ricerca di droga dei topi dipendenti, sono state somministrate due iniezioni sottocutanee a intervalli di 12 ore. Questo modello murino di dipendenza da nicotina è utile per simulare le abitudini umane di fumo e l’esposizione alla silice.
I modelli animali a fattore singolo hanno limitazioni negli studi sulle malattie, mentre il metodo qui descritto coinvolge un modello murino a due fattori di co-esposizione a nicotina e silice. Prima dell’esposizione alla silice, i topi sono stati pre-esposti alla nicotina per replicare l’esposizione alla nicotina nelle persone che fumano. Successivamente, l’esposizione alla silice ha avuto luogo dal giorno 5 al giorno 19 per imitare l’esposizione alla silice in un ambiente di lavoro per individui con una storia di fumo.
I macrofagi alveolari sono noti per svolgere un ruolo significativo nella regolazione dell’infiammazione polmonare e della fibrosi. I macrofagi non possono scomporre la silice dopo l’inalazione di silice, portando alla polarizzazione dei macrofagi o all’apoptosi9 e al rilascio di citochine come il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) e il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β). I macrofagi M1, che sono identificati dalla presenza del marcatore di superficie CD86, sono i principali istigatori della risposta infiammatoria nella silicosi, mentre i macrofagi M2, che sono marcati da CD206, sono responsabili della fase fibrotica della condizione10. Nei topi a doppia esposizione, la nicotina ha indotto la polarizzazione dei macrofagi verso il fenotipo M2 nei polmoni danneggiati dalla silice, promuovendo così la fibrosi polmonare. Inoltre, il TGF-β1 è fondamentale per l’induzione della fibrosi e dell’EMT11; l’aumento dell’espressione di TGF-β1 ha accelerato la progressione della fibrosi polmonare attraverso l’EMT. Questo modello ha analizzato con successo gli effetti della nicotina sulla silicosi e ha ulteriormente evidenziato l’importanza della cessazione della nicotina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un modello animale a doppia esposizione è necessario per studiare il ruolo e i potenziali meccanismi dell’esposizione concomitante alla nicotina e al biossido di silicio cristallino. Questo modello è stato realizzato in questo lavoro attraverso l’iniezione sottocutanea di nicotina e il gocciolamento nasale di silice. Per garantire il successo dell’iniezione di nicotina, l’operatore deve acquisire familiarità con la presa dei topi, poiché afferrare la pelle nella parte posteriore del collo potrebbe essere doloroso per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal programma di innovazione della sinergia universitaria della provincia di Anhui (GXXT-2021-077) e dal Fondo per l’innovazione dei laureati dell’Università di scienza e tecnologia dell’Anhui (2021CX2120).
Materials
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
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