肺上皮間葉転換を促進するためのシリカ曝露マウスモデルでのニコチンの使用
Summary
この研究では、実験的な珪肺症マウスの肺線維症の進行に対するニコチンの相乗効果を研究するためのマウスモデルについて説明します。二重曝露マウスモデルは、ニコチンとシリカに同時に曝露した後の肺の病理学的進行をシミュレートします。説明されている方法は単純で再現性が高いです。
Abstract
喫煙とシリカへの曝露は職業労働者の間で一般的であり、シリカは非喫煙者よりも喫煙者の肺を傷つける可能性が高くなります。タバコの主要な中毒性成分であるニコチンが珪肺症の発症に果たす役割は不明です。本研究で用いたマウスモデルは、単純で制御が容易であり、ヒトの上皮間葉転換による肺線維症に対する慢性ニコチン摂取とシリカへの反復曝露の影響を効果的にシミュレートしました。さらに、このモデルは、タバコの煙に含まれる他の成分の影響を回避しながら、珪肺症に対するニコチンの影響を直接研究するのに役立ちます。
環境適応後、マウスに0.25mg/kgのニコチン溶液を首の上のゆるい皮膚に、毎朝夕方、12時間間隔で40日間皮下注射した。さらに、結晶性シリカ粉末(1〜5μm)を通常の生理食塩水に懸濁し、20mg/mLの懸濁液に希釈し、超音波水浴を用いて均一に分散させた。イソフルラン麻酔をかけたマウスは、このシリカダスト懸濁液50μLを鼻から吸入し、胸部マッサージ で 目覚めさせた。シリカ曝露は、5〜19日目に毎日投与されました。
二重ばく露マウスモデルをニコチンにばく露し、次にシリカにばく露したが、これは両方の有害因子にばく露された労働者のばく露歴と一致した。さらに、ニコチンはマウスの上皮間葉転換(EMT)を介して肺線維症を促進しました。この動物モデルは、珪肺症の発症に対する複数の要因の影響を研究するために使用できます。
Introduction
作業者のシリカ曝露は、一部の職業環境では避けられず、一度シリカに曝露すると、環境から除去した後でも劣化が進行します。さらに、これらの労働者のほとんどが喫煙しており、従来のタバコには何千もの化学物質が含まれており、主な中毒性成分はニコチン1です。電子たばこは、若い年齢層でますます人気が高まっています2。これらの電子タバコはニコチン送達システムとして機能し、ニコチンへのアクセスを増加させ、肺感受性と肺炎を増加させます3。また、タバコの煙は、ブレオマイシンに曝露されたマウスの肺線維症を加速し4、シリカに曝露されたマウスの肺毒性と線維症を増加させます5,6。ただし、ニコチンがシリカによって引き起こされる炎症性および肺線維症プロセスに影響を与える可能性があるかどうかは、まだ調査されていません。
高用量のシリカを気管に1回吸入することによって確立された珪肺症マウスモデルは、マウスにとって外傷性です。この方法では、珪肺症モデルがすぐに提供されますが、作業者が繰り返しシリカにさらされる環境の現実には一致しません。そこで、点鼻薬 で 低用量のシリカ懸濁液を繰り返し投与することで、シリカ曝露マウスモデルを確立しました。この用量は、マウスに炎症や線維症を引き起こす可能性があります。.
他のタバコ成分の影響を回避するために、このマウスモデルを首のゆるい皮膚にニコチンを皮下注射し、中毒性成分であるニコチンが珪肺症に及ぼす影響を測定しました。皮下注射を投与することで、正確な投与が可能となり、ニコチン曝露モデルの作成や用量毒性反応、中毒の観察が可能になります。ニコチン中毒モデルは、0.2-0.4 mg / kg 7,8のニコチン注射用量で、雄マウスで開発されています。このモデルでは、中毒マウスの薬物探索ニーズを満たすために、12時間間隔で2回の皮下注射を行った。このマウスのニコチン依存症モデルは、ヒトの喫煙習慣とシリカへの曝露をシミュレートするのに役立ちます。
単一因子動物モデルには疾患研究の限界があるのに対し、ここで説明する方法は、ニコチンとシリカの共曝露の2因子マウスモデルを含みます。シリカ曝露の前に、マウスは喫煙者のニコチン曝露を再現するためにニコチンに事前曝露されました。その後、喫煙歴のある個人の作業環境でシリカ曝露を模倣するために、5日目から19日目までシリカ曝露が行われました。
肺胞マクロファージは、肺の炎症や線維化の調節に重要な役割を果たすことが知られています。マクロファージはシリカを吸入してもシリカを分解できず、マクロファージの分極またはアポトーシス9 を引き起こし、腫瘍壊死因子α(TNF-α)やトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)などのサイトカインを放出します。表面マーカーCD86の存在によって識別されるM1マクロファージは、珪肺症における炎症反応の主要な扇動者であり、CD206によってマークされるM2マクロファージは、状態10の線維化期の原因である。二重ばく露マウスでは、ニコチンはシリカ損傷肺のマクロファージのM2表現型への分極を誘導し、肺線維症を促進しました。さらに、TGF-β1は線維症およびEMT11の誘導の鍵である。TGF-β1の発現増加は、EMTによる肺線維症の進行を加速させました。このモデルは、珪肺症に対するニコチンの効果を分析することに成功し、ニコチン禁煙の重要性をさらに強調しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ニコチンと結晶性二酸化ケイ素への同時曝露の役割と潜在的なメカニズムを調査するには、二重曝露動物モデルが必要です。このモデルは、ニコチンの皮下注射とシリカの点鼻滴によってこの作業で達成されました。ニコチン注射を成功させるには、首の後ろの皮膚をつかむと痛みを伴う可能性があるため、オペレーターはマウスのつかみ方に慣れる必要があります。したがって、マウスが?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、安徽省大学シナジーイノベーションプログラム(GXXT-2021-077)および安徽科技大学大学院イノベーション基金(2021CX2120)の支援を受けて行われました。
Materials
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
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