Detta protokoll beskriver en teknik för cybridgenerering från suspensionsväxande cancerceller som ett verktyg för att studera mitokondriernas roll i den tumörframkallande processen.
Under de senaste åren har antalet studier som syftar till att fastställa sambandet mellan mitokondrier och cancer ökat avsevärt. Men mer ansträngningar behövs fortfarande för att fullt ut förstå kopplingen som involverar förändringar i mitokondrier och tumörgenes, samt att identifiera tumörassocierade mitokondriella fenotyper. Till exempel, för att utvärdera mitokondriernas bidrag till tumörgenes och metastaseringsprocesser, är det viktigt att förstå påverkan av mitokondrier från tumörceller i olika kärnmiljöer. För detta ändamål består ett möjligt tillvägagångssätt av att överföra mitokondrier till en annan kärnbakgrund för att erhålla de så kallade cybridcellerna. I de traditionella cybridiseringsteknikerna återbefolkas en cellinje som saknar mtDNA (ρ0, kärndonatorcell) med mitokondrier härrörande från antingen enukleerade celler eller blodplättar. Enukleationsprocessen kräver dock god celladhesion till odlingsplattan, en egenskap som delvis eller helt förloras i många fall i invasiva celler. Dessutom är en annan svårighet som finns i de traditionella metoderna att uppnå fullständigt avlägsnande av det endogena mtDNA från mitokondriell mottagarcellinje för att erhålla ren kärn- och mitokondriell DNA-bakgrund, vilket undviker närvaron av två olika mtDNA-arter i den genererade cybriden. I detta arbete presenterar vi ett mitokondriellt utbytesprotokoll applicerat på suspensionsväxande cancerceller baserat på återinsättning av rhodamin 6G-förbehandlade celler med isolerade mitokondrier. Denna metod gör det möjligt för oss att övervinna begränsningarna i de traditionella tillvägagångssätten och kan därmed användas som ett verktyg för att utöka förståelsen av mitokondriell roll i cancerprogression och metastasering.
Omprogrammering av energimetabolism är ett kännetecken för cancer1 som observerades för första gången av Otto Warburg på 1930-talet2. Under aeroba förhållanden omvandlar normala celler glukos till pyruvat, som sedan genererar acetyl-coA, driver mitokondriella maskineriet och främjar cellulär andning. Ändå visade Warburg att även under normoxiska förhållanden omvandlar de flesta cancerceller pyruvat erhållet från glykolysprocessen till laktat och flyttar sig för att erhålla energi. Denna metaboliska justering är känd som “Warburg-effekten” och gör det möjligt för vissa cancerceller att tillgodose sina energiska krav på snabb tillväxt och delning, trots att de genererar ATP mindre effektivt än den aeroba processen 3,4,5. Under de senaste decennierna har många verk stött implikationen av metabolism omprogrammering i cancerprogression. Därför anses tumörenergetik vara ett intressant mål mot cancer1. Som ett centralt nav i energisk metabolism och i tillförseln av väsentliga prekursorer spelar mitokondrier en nyckelroll i dessa cellanpassningar som vi hittills bara delvis förstår.
I linje med ovanstående har mitokondriella DNA-mutationer (mtDNA) föreslagits som en av de möjliga orsakerna till denna metaboliska omprogrammering, vilket kan leda till en försämrad elektrontransportkedja (ETC) prestanda6 och skulle förklara varför vissa cancerceller förbättrar sin glykolytiska metabolism för att överleva. Det har faktiskt rapporterats att mtDNA ackumulerar mutationer i cancerceller, som finns i minst 50% av tumörerna7. Till exempel rapporterade en nyligen genomförd studie utförd av Yuan et al. närvaron av hypermuterade och trunkerade mtDNA-molekyler i njur-, kolorektal- och sköldkörtelcancer8. Dessutom har många arbeten visat att vissa mtDNA-mutationer är associerade med en mer aggressiv tumörfenotyp och med en ökning av den metastatiska potentialen hos cancerceller 9,10,11,12,13,14,15,16.
Trots den uppenbara relevansen av mitokondriellt genom i cancerprogression har studien av dessa mutationer och deras bidrag till sjukdomen varit utmanande på grund av begränsningar i de experimentella modeller och tekniker som för närvarande finns tillgängliga17. Således behövs nya tekniker för att förstå den verkliga effekten av mitokondri-DNA i utveckling och progression av cancersjukdomar. I detta arbete introducerar vi ett protokoll för transmitokondriell cybridgenerering från suspensionsväxande cancerceller, baserat på återinsättning av rhodamin 6G-förbehandlade celler med isolerade mitokondrier, som övervinner de viktigaste utmaningarna med traditionella cybridiseringsmetoder18,19. Denna metod tillåter användning av alla kärndonatorer oavsett tillgängligheten av deras motsvarande ρ 0-cellinje och överföring av mitokondrier från celler som, enligt de traditionella teknikerna, skulle vara svåra att enukleera (dvs icke-vidhäftande cellinjer).
Sedan Otto Warburg rapporterade att cancerceller skiftar sin ämnesomsättning och förstärker “aerob glykolys”3,4 samtidigt som mitokondriell andning minskar, har intresset för mitokondriernas roll i cancertransformation och progression ökat exponentiellt. Under de senaste åren har mutationer i mtDNA och mitokondriell dysfunktion postulerats som kännetecken för många cancertyper25. Hittills har många studier analyserat mtDNA-varia…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning finansierades av bidragsnummer PID2019-105128RB-I00 till RSA, JMB och AA, och PGC2018-095795-B-I00 till PFS och RML, båda finansierade av MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 och bidragsnummer B31_20R (RSA, JMA och AA) och E35_17R (PFS och RML) och finansierades av Gobierno de Aragón. RSA:s arbete stöddes av ett bidrag från Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Författarna vill erkänna användningen av Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
Boric acid | PanReac | 131015 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
EDTA | PanReac | 131026 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
Geneticin | Gibco | 10131027 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
SspI | New England Biolabs | R3132 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris | PanReac | P14030b | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |