Summary

Transmitokondriell cybridgenerering med hjälp av cancercellinjer

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver en teknik för cybridgenerering från suspensionsväxande cancerceller som ett verktyg för att studera mitokondriernas roll i den tumörframkallande processen.

Abstract

Under de senaste åren har antalet studier som syftar till att fastställa sambandet mellan mitokondrier och cancer ökat avsevärt. Men mer ansträngningar behövs fortfarande för att fullt ut förstå kopplingen som involverar förändringar i mitokondrier och tumörgenes, samt att identifiera tumörassocierade mitokondriella fenotyper. Till exempel, för att utvärdera mitokondriernas bidrag till tumörgenes och metastaseringsprocesser, är det viktigt att förstå påverkan av mitokondrier från tumörceller i olika kärnmiljöer. För detta ändamål består ett möjligt tillvägagångssätt av att överföra mitokondrier till en annan kärnbakgrund för att erhålla de så kallade cybridcellerna. I de traditionella cybridiseringsteknikerna återbefolkas en cellinje som saknar mtDNA (ρ0, kärndonatorcell) med mitokondrier härrörande från antingen enukleerade celler eller blodplättar. Enukleationsprocessen kräver dock god celladhesion till odlingsplattan, en egenskap som delvis eller helt förloras i många fall i invasiva celler. Dessutom är en annan svårighet som finns i de traditionella metoderna att uppnå fullständigt avlägsnande av det endogena mtDNA från mitokondriell mottagarcellinje för att erhålla ren kärn- och mitokondriell DNA-bakgrund, vilket undviker närvaron av två olika mtDNA-arter i den genererade cybriden. I detta arbete presenterar vi ett mitokondriellt utbytesprotokoll applicerat på suspensionsväxande cancerceller baserat på återinsättning av rhodamin 6G-förbehandlade celler med isolerade mitokondrier. Denna metod gör det möjligt för oss att övervinna begränsningarna i de traditionella tillvägagångssätten och kan därmed användas som ett verktyg för att utöka förståelsen av mitokondriell roll i cancerprogression och metastasering.

Introduction

Omprogrammering av energimetabolism är ett kännetecken för cancer1 som observerades för första gången av Otto Warburg på 1930-talet2. Under aeroba förhållanden omvandlar normala celler glukos till pyruvat, som sedan genererar acetyl-coA, driver mitokondriella maskineriet och främjar cellulär andning. Ändå visade Warburg att även under normoxiska förhållanden omvandlar de flesta cancerceller pyruvat erhållet från glykolysprocessen till laktat och flyttar sig för att erhålla energi. Denna metaboliska justering är känd som “Warburg-effekten” och gör det möjligt för vissa cancerceller att tillgodose sina energiska krav på snabb tillväxt och delning, trots att de genererar ATP mindre effektivt än den aeroba processen 3,4,5. Under de senaste decennierna har många verk stött implikationen av metabolism omprogrammering i cancerprogression. Därför anses tumörenergetik vara ett intressant mål mot cancer1. Som ett centralt nav i energisk metabolism och i tillförseln av väsentliga prekursorer spelar mitokondrier en nyckelroll i dessa cellanpassningar som vi hittills bara delvis förstår.

I linje med ovanstående har mitokondriella DNA-mutationer (mtDNA) föreslagits som en av de möjliga orsakerna till denna metaboliska omprogrammering, vilket kan leda till en försämrad elektrontransportkedja (ETC) prestanda6 och skulle förklara varför vissa cancerceller förbättrar sin glykolytiska metabolism för att överleva. Det har faktiskt rapporterats att mtDNA ackumulerar mutationer i cancerceller, som finns i minst 50% av tumörerna7. Till exempel rapporterade en nyligen genomförd studie utförd av Yuan et al. närvaron av hypermuterade och trunkerade mtDNA-molekyler i njur-, kolorektal- och sköldkörtelcancer8. Dessutom har många arbeten visat att vissa mtDNA-mutationer är associerade med en mer aggressiv tumörfenotyp och med en ökning av den metastatiska potentialen hos cancerceller 9,10,11,12,13,14,15,16.

Trots den uppenbara relevansen av mitokondriellt genom i cancerprogression har studien av dessa mutationer och deras bidrag till sjukdomen varit utmanande på grund av begränsningar i de experimentella modeller och tekniker som för närvarande finns tillgängliga17. Således behövs nya tekniker för att förstå den verkliga effekten av mitokondri-DNA i utveckling och progression av cancersjukdomar. I detta arbete introducerar vi ett protokoll för transmitokondriell cybridgenerering från suspensionsväxande cancerceller, baserat på återinsättning av rhodamin 6G-förbehandlade celler med isolerade mitokondrier, som övervinner de viktigaste utmaningarna med traditionella cybridiseringsmetoder18,19. Denna metod tillåter användning av alla kärndonatorer oavsett tillgängligheten av deras motsvarande ρ 0-cellinje och överföring av mitokondrier från celler som, enligt de traditionella teknikerna, skulle vara svåra att enukleera (dvs icke-vidhäftande cellinjer).

Protocol

Anmärkning: Alla odlingssubstrat och buffertsammansättningar specificeras i tabell 1. Före cybridgenerering måste både mitokondriella och nukleära DNA-profiler från givar- och mottagarcellerna skrivas för att bekräfta förekomsten av genetiska skillnader i båda genomerna mellan cellinjerna. I denna studie användes en kommersiellt tillgänglig L929-cellinje och dess härledda cellinje, L929dt, som genererades spontant i vårt laboratorium (se13 för mer information). Des…

Representative Results

Efter att ha följt det ovan presenterade protokollet bör en homoplasmatisk cybridcellinje med bevarad kärnbakgrund men med en ny mitokondriernas genotyp erhållas, såsom representeras i schemat i figur 1 och figur 2. Renheten hos mitokondriellt och nukleärt DNA i cybriderna kan bekräftas med RFLP, som visas i figur 3, och genom nukleär DNA-genotypanalys, som visas i figur 4. <p class="jove_co…

Discussion

Sedan Otto Warburg rapporterade att cancerceller skiftar sin ämnesomsättning och förstärker “aerob glykolys”3,4 samtidigt som mitokondriell andning minskar, har intresset för mitokondriernas roll i cancertransformation och progression ökat exponentiellt. Under de senaste åren har mutationer i mtDNA och mitokondriell dysfunktion postulerats som kännetecken för många cancertyper25. Hittills har många studier analyserat mtDNA-varia…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning finansierades av bidragsnummer PID2019-105128RB-I00 till RSA, JMB och AA, och PGC2018-095795-B-I00 till PFS och RML, båda finansierade av MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 och bidragsnummer B31_20R (RSA, JMA och AA) och E35_17R (PFS och RML) och finansierades av Gobierno de Aragón. RSA:s arbete stöddes av ett bidrag från Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Författarna vill erkänna användningen av Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

Materials

3500XL Genetic Analyzer  ThermoFisher Scientific 4406016
6-well plate Corning 08-772-1B
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit ThermoFisher Scientific 4427368
Anode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4393927
Boric acid PanReac 131015
Bradford assay Biorad 5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4408256
Cell culture flasks TPP 90076
DMEM high glucose Gibco 11965092
EDTA PanReac 131026
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E8751
Geneticin Gibco 10131027
Homogenizer Teflon pestle Deltalab 196102
L929 cell line ATCC CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System BioRad 1658004
MOPS Sigma-Aldrich M1254
PCR primers Sigma-Aldrich Custom products
Polyacrylamide Solution 30% PanReac A3626
Polyethylene glycol Sigma-Aldrich P7181
POP-7 Applied Biosystems 4393714
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
QIAmp DNA Mini Kit Qiagen 51306
Rhodamine-6G Sigma-Aldrich R4127
Serum Fetal Bovine Sigma-Aldrich F7524
SspI New England Biolabs R3132
Streptomycin/penicillin PAN biotech P06-07100
Sucrose Sigma-Aldrich S3089
TEMED Sigma-Aldrich T9281
Tris PanReac P14030b
Uridine Sigma-Aldrich U3750

References

  1. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  2. Wind, F., Warburg, O. H. . The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , (1930).
  3. Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
  4. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  5. Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
  6. Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
  7. Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
  8. Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
  9. Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
  10. Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
  11. Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
  12. Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
  13. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
  14. Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
  15. Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
  16. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"–a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
  17. Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
  18. Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
  19. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  20. Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
  21. Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
  22. Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  24. Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
  25. Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
  26. Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
  27. Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
  28. Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
  29. Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
  30. Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
  31. Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
  32. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  33. Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
  34. Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
  35. Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
  36. Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
  37. Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
  38. Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
  39. Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
  40. Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
  41. Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
  42. Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
  43. Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
  44. Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
  45. Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
  46. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
  47. Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
  48. Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
  49. Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
  50. Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
  51. Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
  52. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).

Play Video

Cite This Article
Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., Fernández-Silva, P., Mozas, P., Anel, A., Moreno Loshuertos, R. Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (193), e65186, doi:10.3791/65186 (2023).

View Video