Isolement et culture de macrophages synoviaux primaires et de fibroblastes à partir de tissus arthritiques murins
Summary
La présente étude fournit un protocole modifié pour isoler les macrophages synoviaux et les fibroblastes du tissu arthritique inflammatoire murin.
Abstract
La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune qui entraîne une inflammation chronique des articulations. Les macrophages synoviaux et les fibroblastes synoviaux jouent un rôle central dans la pathogenèse de la polyarthrite rhumatoïde. Il est important de comprendre les fonctions des deux populations cellulaires pour révéler les mécanismes sous-jacents à la progression pathologique et à la rémission de l’arthrite inflammatoire. En général, les conditions expérimentales in vitro devraient imiter autant que possible l’environnement in vivo . Des cellules dérivées de tissus primaires ont été utilisées dans des expériences caractérisant les fibroblastes synoviaux dans l’arthrite. En revanche, dans les expériences portant sur les fonctions biologiques des macrophages dans l’arthrite inflammatoire, des lignées cellulaires, des macrophages dérivés de la moelle osseuse et des macrophages dérivés de monocytes sanguins ont été utilisés. Cependant, il n’est pas clair si ces macrophages reflètent réellement les fonctions des macrophages résidant dans les tissus. Pour obtenir des macrophages résidents, les protocoles précédents ont été modifiés pour isoler et développer à la fois les macrophages primaires et les fibroblastes du tissu synovial dans un modèle murin d’arthrite inflammatoire. Ces cellules synoviales primaires peuvent être utiles pour l’analyse in vitro de l’arthrite inflammatoire.
Introduction
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune caractérisée par une hyperplasie de la synoviale, entraînant une destruction articulaire 1,2. Les macrophages et les fibroblastes résidant dans les tissus sont présents dans la synoviale saine pour maintenir l’homéostasie articulaire. Chez les patients atteints de PR, les fibroblastes synoviaux (SF) prolifèrent et les cellules immunitaires, y compris les monocytes, s’infiltrent dans la synoviale et le liquide articulaire, processus associés à l’inflammation 1,3,4. Les macrophages synoviaux (SM), qui comprennent les macrophages résidents et les macrophages dérivés de monocytes du sang périphérique, et les SF sont activés de manière aberrante et jouent un rôle important dans la pathogenèse de la PR. Des études récentes ont suggéré que les interactions cellule-cellule entre les SM et les SF contribuent à la fois à l’exacerbation et à la rémission de la PR 5,6.
Pour comprendre la pathogenèse de la PR, plusieurs modèles d’arthrite inflammatoire chez les rongeurs ont été utilisés, notamment l’arthrite par transfert sérique K/BxN, l’arthrite induite par le collagène et l’arthrite induite par les anticorps anticollagène. Les tests cellulaires sont généralement nécessaires pour clarifier les fonctions moléculaires dans l’arthrite. Par conséquent, des cellules primaires provenant de modèles animaux d’arthrite ont été isolées. La méthode pour isoler les SF du tissu arthritique murin est bien établie, et ces cellules ont contribué à l’élucidation des mécanismes moléculaires dans la pathogenèsede l’arthrite 7,8. D’autre part, les macrophages dérivés de la moelle osseuse, les macrophages dérivés de monocytes sanguins et les lignées cellulaires de macrophages ont souvent été utilisés comme ressources en macrophages pour les études sur l’arthrite 9,10. Étant donné que les macrophages peuvent acquérir des fonctions associées à leur microenvironnement, les sources générales de macrophages peuvent manquer de réponses spécifiques aux tissus arthritiques. De plus, il est difficile d’obtenir suffisamment de cellules synoviales par tri, car la synoviale murine est un très petit tissu, même dans les modèles d’arthrite. Le manque d’utilisation des macrophages synoviaux pour les études in vitro a été une limitation dans les études sur l’arthrite. L’établissement d’un protocole pour isoler et étendre les macrophages synoviaux serait un avantage pour l’élucidation des mécanismes pathologiques dans la PR.
Dans la méthode précédente d’isolement des FS, les SM étaient éliminés7. En outre, une méthode pour isoler et développer les macrophages résidents de certains organes a été signalée11. Par conséquent, les protocoles existants ont été modifiés en combinaison. La modification vise à atteindre la culture primaire des SM et des SF avec une grande pureté. L’objectif global de cette méthode est d’isoler et d’étendre les SM et les SF à partir du tissu arthritique murin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode développée ici améliore les techniques précédentes pour isoler à la fois les SF de l’arthrite murine et les macrophages résidents d’un certain nombre d’organes 7,11. La méthode modifiée peut isoler à la fois les macrophages et les fibroblastes de la synoviale inflammatoire avec une grande pureté, et elle est simple et reproductible. Étant donné que la méthode ne nécessite pas d’instruments complexes tels qu’un trieur de cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le personnel de la Division of Medical Research Support, du Advanced Research Support Center (ADRES) et les membres de la Division of Integrative Pathophysiology, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, pour leur assistance technique et leur soutien utile. Cette étude a été financée en partie par les subventions KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (à NS) et JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (à YI); des subventions de la Fondation de recherche médicale d’Osaka pour les maladies intraitables, de la Fondation Nakatomi, de la Bourse des étoiles montantes de la Société japonaise de recherche sur les os et les minéraux (JSBMR), de la Fondation Sumitomo, de la Fondation de recherche médicale SENSHIN, de la Fondation Mochida Memorial (à la Nouvelle-Écosse); et une subvention de recherche médicale de la Takeda Science Foundation, une subvention de projet UCB Japan (UCBJ) et la subvention JSBMR Frontier Scientist 2019 (à YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
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