Aislamiento y cultivo de macrófagos sinoviales primarios y fibroblastos a partir de tejido murino de artritis
Summary
El presente estudio proporciona un protocolo modificado para aislar macrófagos sinoviales y fibroblastos del tejido de artritis inflamatoria murina.
Abstract
La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune que provoca una inflamación crónica de las articulaciones. Los macrófagos sinoviales y los fibroblastos sinoviales tienen un papel central en la patogénesis de la artritis reumatoide. Es importante comprender las funciones de ambas poblaciones celulares para revelar los mecanismos subyacentes a la progresión patológica y la remisión en la artritis inflamatoria. En general, las condiciones experimentales in vitro deben imitar el entorno in vivo tanto como sea posible. Las células derivadas de tejidos primarios se han utilizado en experimentos que caracterizan los fibroblastos sinoviales en la artritis. Por el contrario, en experimentos que investigan las funciones biológicas de los macrófagos en la artritis inflamatoria, se han utilizado líneas celulares, macrófagos derivados de la médula ósea y macrófagos derivados de monocitos sanguíneos. Sin embargo, no está claro si estos macrófagos reflejan realmente las funciones de los macrófagos residentes en los tejidos. Para obtener macrófagos residentes, se modificaron los protocolos anteriores para aislar y expandir tanto los macrófagos primarios como los fibroblastos del tejido sinovial en un modelo de ratón con artritis inflamatoria. Estas células sinoviales primarias pueden ser útiles para el análisis in vitro de la artritis inflamatoria.
Introduction
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por hiperplasia de la membrana sinovial, que conduce a la destrucción articular 1,2. Los macrófagos y fibroblastos residentes en los tejidos están presentes en la membrana sinovial sana para mantener la homeostasis articular. En los pacientes con AR, los fibroblastos sinoviales (SF) proliferan y las células inmunitarias, incluidos los monocitos, se infiltran en la membrana sinovial y en el líquido articular, procesos asociados a la inflamación 1,3,4. Los macrófagos sinoviales (SM), que incluyen los macrófagos residentes y los macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica, y los SF se activan de forma aberrante y tienen un papel importante en la patogénesis de la AR. Estudios recientes han sugerido que las interacciones célula-célula entre los SM y los SF contribuyen tanto a la exacerbación como a la remisión de la AR 5,6.
Para comprender la patogénesis de la AR, se han utilizado varios modelos de artritis inflamatoria en roedores, incluida la artritis por transferencia sérica K/BxN, la artritis inducida por colágeno y la artritis inducida por anticuerpos de colágeno. Por lo general, se requieren ensayos basados en células para aclarar las funciones moleculares en la artritis. Por lo tanto, se han aislado células primarias de modelos animales de artritis. El método para aislar los SF del tejido murino de la artritis está bien establecido, y estas células han contribuido a la elucidación de los mecanismos moleculares en la patogénesis de la artritis 7,8. Por otro lado, los macrófagos derivados de la médula ósea, los macrófagos derivados de monocitos sanguíneos y las líneas celulares de macrófagos se han utilizado a menudo como recursos de macrófagos para estudios de artritis 9,10. Dado que los macrófagos pueden adquirir funciones asociadas con su microambiente, las fuentes generales de macrófagos pueden carecer de respuestas específicas para el tejido de la artritis. Además, es difícil obtener suficientes células sinoviales mediante la clasificación, ya que la membrana sinovial murina es un tejido muy pequeño incluso en modelos de artritis. La falta de uso de macrófagos sinoviales para estudios in vitro ha sido una limitación en los estudios de artritis. El establecimiento de un protocolo para aislar y expandir los macrófagos sinoviales sería una ventaja para la elucidación de los mecanismos patológicos en la AR.
En el método anterior para aislar SFs, los SMs fueron descartados7. Además de eso, se reportó un método para aislar y expandir macrófagos residentes de algunos órganos11. Por lo tanto, los protocolos existentes se modificaron en combinación. La modificación tiene como objetivo lograr el cultivo primario tanto de SM como de SF con alta pureza. El objetivo general de este método es aislar y expandir tanto los SM como los SF del tejido de la artritis murina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método desarrollado aquí mejora las técnicas anteriores para aislar tanto los SF de la artritis murina como los macrófagos residentes de varios órganos 7,11. El método modificado puede aislar tanto macrófagos como fibroblastos de la membrana sinovial inflamatoria con alta pureza, y es simple y reproducible. Dado que el método no requiere instrumentos complejos como un clasificador de células, cualquiera puede realizarlo. Además, la presente técnic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al personal de la División de Apoyo a la Investigación Médica, el Centro de Apoyo a la Investigación Avanzada (ADRES) y a los miembros de la División de Fisiopatología Integrativa del Centro de Proteociencia (PROS) de la Universidad de Ehime, por su asistencia técnica y apoyo útil. Este estudio fue financiado en parte por las subvenciones KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (a NS) y JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (a YI); subvenciones de la Fundación de Investigación Médica de Osaka para Enfermedades Intratables, la Fundación Nakatomi, la Beca Rising Stars de la Sociedad Japonesa para la Investigación Ósea y Mineral (JSBMR), la Fundación Sumitomo, la Fundación de Investigación Médica SENSHIN, la Fundación Mochida Memorial (a NS); y una beca de investigación médica de la Fundación Takeda de Ciencias, una beca de proyecto UCB Japón (UCBJ) y la beca JSBMR Frontier Scientist 2019 (a YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
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