Summary
نقدم خطوة بخطوة تعليمات لتوليد الوهم حديثي الولادة ، فضلا عن تشريح وإعداد الغدة الصعترية لخارج الجسم بواسطة التصوير 2 - فوتون الميكروسكوب.
Abstract
الميكروسكوب ثنائي الفوتون (TPM) يتيح لنا صورة عميقة في الغدة الصعترية وتوثيق الأحداث التي تعتبر مهمة لتطوير خلية توتية. لمتابعة هجرة الأفراد في حشد من thymocytes ، فإننا توليد الوهم حديثي الولادة حيث يتم استخلاص أقل من واحد في المئة من thymocytes من الجهات المانحة التي تم المعدلة وراثيا لبروتين فلوري أعرب بتواجد مطلق. لإنشاء هذه الجزئية hematopoetic الوهم ، يتم حقن الأطفال حديثي الولادة مع متلقي نخاع العظم بين 3-7 أيام من العمر. بعد 4-6 أسابيع ، يتم التضحية الماوس ويتم تشريح بعناية التوتة bissected والحفاظ على بنية النسيج التي سيتم تصويرها. يتم لصقها الغدة الصعترية في الصعود إلى ساترة استعدادا للخارج الجسم بواسطة التصوير TPM. أثناء التصوير يتم الاحتفاظ بها في الغدة الصعترية DMEM دون الحمراء الفينول التي perfused مع الأكسجين 95 ٪ و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون ودرجة حرارة إلى 37 درجة مئوية. باستخدام هذا النهج ، يمكننا دراسة الأحداث اللازمة لجيل من ذخيرة متنوعة الخلايا التائية.
Protocol
نقل بالتبني
حقن الولدان مع 50 100ul من نخاع العظام باستخدام حقنة الانسولين 2-4 مرات خلال الأيام 3-7 الأولى من الحياة ، مع نسبة المانحة إلى المضيف النهائي 1:1. تهدف لموقع الحقن تحت القص والقفص الصدري ، ولكن قبل الأمعاء والمعدة. ادخال الإبرة بعيدا بما فيه الكفاية لاختراق الغشاء البريتوني ، الحرص على عدم ثقب في الحجاب الحاجز. ليس من غير المألوف أن يكون لفقدان بعض من نخاع العظم خلال الحقن. يمكنك تقليل الخسائر من خلال تخفيف قبضة الخاص بك على الجرو كما كنت حقن بحيث يسمح للجلد لتوسيع و، ثم ، وإزالة الإبرة ببطء.
تشريح الغدة الصعترية
إجراء شق طريق خط الوسط وقطع أو تمزق الجلد بعيدا لكشف القفص الصدري. الابقاء على القص وقطع طريق الصفاق والحجاب الحاجز. تقطيع جانبي القفص الصدري لكشف التجويف الصدري. الغدة الصعترية تقع على الجزء العلوي من القلب. وذلك للحفاظ على بنية الغدة الصعترية ، الابقاء على الأنسجة المحيطة بها كما كنت تشريح الغدة الصعترية. شطف التوتة مع برنامج تلفزيوني للحفاظ عليه من الجفاف أثناء تشريح. ندف بلطف بعيدا الأنسجة الزائدة على سطح الكبسولة التوتة وشطر من فصين اثنين.
تستعد لتصوير الأنسجة
استخدام البيطري لاصق الأنسجة لالغراء الغدة الصعترية لا للساترة مربع. استخدام pipetteman لوضع جزء من ميكروليتر من مادة لاصقة. نشر الغراء على طول وعرض تقريبي الغدة الصعترية. مطرد الغدة الصعترية ضد ساترة وجرها الى المكان.
ثنائي الفوتون التصوير
الغارقة في النسيج DMEM دون الحمراء الفينول التي perfused مع الأكسجين 95 ٪ و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون ودرجة حرارة إلى 37 درجة مئوية. وقد تحقق الإثارة ثنائي الفوتون باستخدام الأطياف ، فيزياء الليزر MaiTai ضبطها ل900nm ، وCFP ، GFP ، YFP وتكساس الضوء الأحمر فصلت الانبعاثات باستخدام 495 ، 515 ، 560 المرايا مزدوج اللون ، والتي تم جمعها باستخدام كاشفات PMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التصوير ثنائي الفوتون في الغدة الصعترية تمكننا من النظر في الهيئات ، الذين يعيشون على حالها والتفاعلات والأحداث التي تكمن وراء الهجرات الاختيار داخل الغدة الصعترية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر مات بول وجيمي وو للمساعدة التقنية.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
