Summary
Мы представляем шаг за шагом инструкции для поколения новорожденных химерами, а также вскрытие и подготовка тимуса для бывших естественных изображений на 2-Фотон микроскопии.
Abstract
Двухфотонное микроскопия (TPM) позволяет нам образ глубоко в вилочковой железе и документировать события, которые имеют важное значение для развития тимоцитов. Для выполнения миграции физических лиц в толпе тимоцитов, мы генерируем новорожденных химерами, где менее чем один процент тимоцитов являются производными от донора, для трансгенных повсеместно выражают флуоресцентного белка. Для создания этих частичных кроветворения химеры, неонатальной получателей вводят костного мозга от 3-7 дней от роду. После 4-6 недель, мыши приносится в жертву и тимуса тщательно расчленены и bissected сохраняя архитектуру ткани, которая будет в образ. Тимус наклеиваются на покровное в рамках подготовки к бывшим естественных изображений по TPM. Во время визуализации тимус хранится в DMEM без фенола красного, который перфузии с 95% кислорода и 5% углекислого газа и нагревают до 37 ° C. Используя этот подход, мы можем изучать события, необходимые для генерации разнообразный репертуар Т-клеток.
Protocol
Приемные Трансфер
Inject новорожденных с 50-100 мкл костного мозга использованием инсулиновый шприц 2-4 раза в течение первых 3-7 дней жизни, с окончательным донор-хост соотношении 1:1. Стремитесь к инъекции ниже грудины и грудной клетки, но, прежде кишки и желудка. Вставьте иглу достаточно далеко, чтобы проникнуть в брюшину, осторожны, чтобы не проколоть мембрану. Она не является редкостью для некоторых из костного мозга, будут потеряны во время инъекции. Вы можете уменьшить потери, ослабив контроль над вашим щенком, как Вы вводите таким образом, чтобы дать коже расширяются и, затем, медленно удаления иглы.
Препарирование Thymus
Сделать разрез через среднюю линию и вырезать или разрыв кожи прочь раскрыть грудную клетку. Держитесь за грудиной и прорезать брюшины и диафрагмы. Нарежьте стороны грудной клетки, чтобы выявить грудной полости. Вилочковой железы лежит на верхней части сердца. Так, чтобы сохранить структуру тимуса, держаться за окружающие ткани, как вы рассекать из вилочковой железы. Промыть тимуса с PBS держать его от высыхания во время вскрытия. Аккуратно дразнить излишки ткани на поверхность капсулы тимуса и делить пополам две лопасти.
Подготовка тканей для работы с изображениями
Используйте ветеринарных клей ткани клеить тимуса не на поле, покровное. Используйте pipetteman поставить долю микролитр клея. Распространение клей приблизительную продолжительность и ширина тимуса. Устойчивый тимуса против покровное и перетащить его на место.
Два-Фотон изображений
Ткань погружается в DMEM без фенола красного, который перфузии с 95% кислорода и 5% углекислого газа и нагревают до 37 ° C. Двухфотонного возбуждения была достигнута с помощью Spectra-Physics Maitai лазера, настроенного на 900 нм, и CFP, GFP, YFP и Техас Красное свечение было отделено использованием 495, 515, 560 дихроичных зеркал и собранные с помощью ФЭУ детекторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Двухфотонное изображений в тимуса позволяет рассматривать в живых, неповрежденных органов взаимодействия и миграции, которые лежат в основе выбора события в тимусе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Мэтта Павел и Джимми Ву для оказания технической помощи.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
