Summary
Yenidoğan kimeralar üretimi yanı sıra 2-Foton Mikroskopi diseksiyonu ve ex vivo görüntüleme için timus hazırlanması için adım adım talimatlar sunuyoruz.
Abstract
İki foton Mikroskobu (TPM) timus derinliklerine görüntü sağlar ve timosit gelişimi için önemli olan olayları belgelemek. Timositleri bir kalabalığın içinde bireylerin göç takip etmek, biz timositleri yüzde birinden daha az yayg ifade floresan protein transgenik bir donörden elde edilen yenidoğan kimeralar üretir. Bu kısmi hematopoetik kimeralar oluşturmak için, yenidoğan alıcılar yaş 3-7 gün arasında kemik iliği ile enjekte edilir. 4-6 hafta sonra, fare kurban ve timus dikkatle diseke ve görüntülü olacak doku mimarisi korunarak bissected. Timus TPM tarafından ex vivo görüntüleme için hazırlık lamel üzerine yapıştırılır. Görüntüleme sırasında timus,% 95 oksijen ve% 5 karbon dioksit ile perfüze ve 37 ısındı fenol kırmızısı ° C olmadan DMEM tutulur Bu yaklaşımı kullanarak, biz, farklı T hücre repertuarının üretimi için gerekli olan olayları incelemek.
Protocol
Evlatlık Transferi
Yenidoğanlarda kemik iliği 50-100ul 1:1 nihai bir donör-to-host oranı ile, yaşamın ilk 3-7 gün boyunca 2-4 kez kullanarak bir insülin enjektörü ile enjekte edilir. Sternum ve kaburga kafesinin altında bir enjeksiyon yerinde, ancak bağırsak ve mide üzerinde yöneltin. Ponksiyon diyafram dikkatli periton, yeteri kadar nüfuz iğne takın. Bazı kemik iliği enjeksiyonu sırasında kaybolan için nadir değildir. Cilt, daha sonra iğne yavaşça kaldırarak, genişletmek ve izin gibi enjekte olarak yavru kavrama gevşeme kaybını azaltmak.
Thymus, diseksiyonu
Orta hat üzerinden bir kesi yapmak ve göğüs kafesi ortaya çıkarmak için cildi kesmek veya yırtılma. Sternum üzerinde tutun ve periton ve diyafram kesti. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs kafesi kenarlarına kadar kesin. Timus, kalp üstünde yatıyor. Şimdiye kadar timus yapısını korumak için, timus teşrih doku çevresindeki tutun. Diseksiyonu sırasında kuruma onu tutmak için PBS ile timus durulayın. Timik kapsül yüzeyinde hafifçe uzak aşırı doku tease ve iki lob iki eşit parçaya böler.
Görüntüleme için Doku Hazırlama
Hayır bir kare lamel tutkal timus veteriner doku yapıştırıcısı kullanın. Pipetteman yapıştırıcı mikrolitrelik bir kısmını koymak için kullanın. Timus yaklaşık uzunluğu ve genişliği tutkal sürün. Sabit lamel karşı timus ve yerine sürükleyin.
İki-Foton Görüntüleme
Doku,% 95 oksijen ve% 5 karbon dioksit ile perfüze ve 37 ısındı fenol kırmızısı ° C olmadan DMEM batmış İki foton uyarma DEVRESEL_ÖDEME dedektörleri kullanarak Spectra-Fizik Maitai 900nm için ayarlanmış lazer, ve CFP, GFP, YFP ve Texas Red emisyon ışık ayrıldı, bir 495, 515, 560 dikroik aynalar ve toplanan kullanılarak elde edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Timus İki foton görüntüleme, yaşam, sağlam organları etkileşimleri ve timus içinde seçim olayların altında yatan göçler incelemek için bize sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz, teknik yardım için Matt Paul ve Jimmy Wu teşekkür ederim.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
