Summary
우리는 신생아 chimeras의 생성뿐만 아니라 2 광자 현미경으로 해부하고 예 생체내 이미징에 대한 thymus의 준비를위한 단계별 지침을 제시한다.
Abstract
두 광자 현미경 (TPM)는 thymus에 깊은 이미지를 우리를있게하고 thymocyte 발전을위한 중요한 이벤트를 문서. thymocytes의 군중에서 개인의 마이 그 레이션을 수행하기 위해, 우리는 thymocytes 미만 1퍼센트가 ubiquitously 표현 형광 단백질에 대한 유전자 변형되는 기증자에서 파생됩니다 신생아 chimeras를 생성합니다. 이러한 부분 hematopoetic chimeras를 생성하려면, 신생아받는 사람은 나이 3-7일 사이에 골수로 주입됩니다. 4~6주 후, 마우스가 희생되고 thymus은 신중하게 해부하고 몇 군데 될 조직의 구조를 보존 bissected. thymus는 TPM의 예 생체내 이미징에 대비하여 coverslip에 붙어있다. 이미징 동안 thymus는 95 % 산소와 5 % 이산화탄소로 perfused 37을 따뜻하게합니다 페놀 레드 ° C.없는 DMEM에 저장됩니다 이 방법을 사용, 우리는 다양한 T 세포 레퍼토리의 생성에 필요한 이벤트를 공부할 수 있습니다.
Protocol
입양 전송
골수 50 - 100ul가 1시 1분의 최종 기증자 대 호스트 비율과 함께, 생명의 첫 3-7일 동안 인슐린 주사기에게 2-4 번 사용하는 neonates을 주사. 흉골과 흉곽 아래에 주사 사이트에 대한하지만 창자와 위 이상을 목표로하고 있습니다. 멀리 충분하지 소중히 다이어프램를 신중 복막을 침투 바늘을 삽입합니다. 골수의 일부가 주사하는 동안 손실되는 것이 일반적입니다. 당신은 피부가 서서히 바늘을 제거하고, 확장하고 수 있도록만큼 주사로 당신은 강아지에 손잡이를 느슨해진하여 손실을 줄일 수 있습니다.
Thymus의 해부
정중선을 통해 절개를 만들고 갈빗대을 나타내기 위해 멀리 피부를 잘라내거나 눈물. 흉골을 잡고 복막 및 격막을 통해 했네요. 흉강을 나타내기 위해 흉곽의 측면을 자르고. thymus은 심장의 정상에 자리잡고 있습니다. 그럼으로 thymus의 구조를 유지하기 위해, 당신이 thymus을 해부하다와 같은 조직을 주변에 만요. 해부하는 동안 밖으로 건조에서 유지하는 PBS로 thymus을 씻어. 부드럽게 thymic 캡슐의 표면에 떨어진 초과 조직을 애타게 두 개의 엽 (叶)을 이등분.
이미징을위한 조직을 준비
광장 coverslip에 아무런 접착제 thymus로 수의과 조직 접착제를 사용하지 않습니다. 접착제의 microliter의 일부를 넣어 pipetteman을 사용합니다. 대략적인 길이 thymus의 너비에 접착제를 펴. 꾸준한는 coverslip에 대한 thymus과 장소로 드래그합니다.
두 광자 이미징
조직은 95 % 산소와 5 % 이산화탄소로 perfused 37을 따뜻하게합니다 페놀 레드 ° C.없는 DMEM에 빠져들 것입니다 두 광자 여기는 PMT 감지기를 사용하여 스펙트럼 - 물리 마이 타이 900nm에 레이저 조정하고, CFP, GFP, YFP와 텍사스 레드 발광 라이트 분리된 495을 사용하여 515, 560 이색성 거울과 수집을 사용하여 달성되었습니다.
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Discussion
thymus에서 두 광자 이미징 살고, 손상 기관 상호 작용과 thymus 내에 선택 이벤트를 기초로 마이 그 레이션 검사 우리에게 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 매트 바울과 기술 지원 지미 님 감사합니다.
References
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- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
