Summary
Nous présentons, étape par étape les instructions pour la génération des chimères néonatale ainsi que la dissection et la préparation du thymus pour l'imagerie ex vivo par microscopie biphotonique 2.
Abstract
Microscopie à deux photons (TPM) nous permet de l'image en profondeur dans le thymus et de documenter les événements qui sont importants pour le développement des thymocytes. Pour suivre la migration des individus dans une foule de thymocytes, nous générons des chimères néonatale où moins de un pour cent des thymocytes sont issus d'un donneur qui est transgénique pour une protéine ubiquitaire expresse fluorescentes. Pour générer ces chimères hématopoïétiques partielle, les bénéficiaires néonatale sont injectés avec de la moelle osseuse entre 3-7 jours d'âge. Après 4-6 semaines, la souris est sacrifiée et le thymus est soigneusement disséquée et bissected préservant l'architecture du tissu qui sera imagé. Le thymus est collé sur une lamelle en préparation pour l'imagerie ex vivo par TPM. Pendant l'imagerie du thymus est conservé dans du DMEM sans rouge de phénol qui est perfusé avec 95% d'oxygène et de dioxyde de carbone de 5% et chauffé à 37 ° C. En utilisant cette approche, nous pouvons étudier les événements requis pour la génération d'un répertoire des cellules T diverses.
Protocol
Le transfert adoptif
Injecter nouveau-nés avec 50 100 ul de la moelle osseuse à l'aide d'une seringue d'insuline 2-4 fois durant les 3-7 premiers jours de vie, avec une finale donateurs-to-host ratio de 1:1. But pour un site d'injection sous le sternum et la cage thoracique, mais au-dessus de l'intestin et l'estomac. Insérez l'aiguille suffisamment loin pour pénétrer le péritoine, attention à ne pas percer la membrane. Il n'est pas rare pour certains de la moelle osseuse d'être perdus lors de l'injection. Vous pouvez réduire la perte en desserrant votre emprise sur le chiot que vous injectez de manière à permettre à la peau de l'expansion et, puis, lentement retirer l'aiguille.
Dissection de Thymus
Faire une incision dans la ligne médiane et couper ou déchirer la peau pour révéler la cage thoracique. Accrochez-vous à le sternum et couper à travers le péritoine et le diaphragme. Coupez les côtés de la cage thoracique pour révéler la cavité thoracique. Le thymus est au-dessus du cœur. Afin de préserver la structure du thymus, s'accrocher à des tissus environnants comme vous disséquer le thymus. Rincer le thymus avec du PBS pour l'empêcher de sécher durant la dissection. Doucement taquiner loin l'excès de tissu sur la surface de la capsule du thymus et coupent les deux lobes.
Préparation des tissus pour l'imagerie
Utilisez une colle tissulaire vétérinaires de coller le thymus pas d'une lamelle carré. Utilisez un pipetteman de mettre une fraction d'un microlitre de colle. Étendre la colle à la longueur et la largeur approximative du thymus. Steady le thymus contre la lamelle et le faire glisser en place.
Deux-Photon Imaging
Le tissu est immergé dans du DMEM sans rouge de phénol qui est perfusé avec 95% d'oxygène et de dioxyde de carbone de 5% et chauffé à 37 ° C. D'excitation à deux photons a été réalisée en utilisant un Spectra-Physics MaiTai laser réglé à 900nm, et de la PCP, la GFP, YFP et Texas Red émission de lumière a été séparé en utilisant un 495, 515, 560 miroirs dichroïques et recueillies à l'aide de détecteurs de PMT.
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Discussion
L'imagerie à deux photons dans le thymus nous permet d'examiner dans la vie, les organes intacts les interactions et les migrations qui sous-tendent les épreuves de sélection dans le thymus.
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Acknowledgments
Nous remercions Matt Paul et Jimmy Wu pour l'assistance technique.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
