Summary
Se presenta paso a paso las instrucciones para la generación de quimeras neonatal, así como la disección y preparación de la timo para la ex vivo de imágenes de 2-fotones microscopía.
Abstract
Microscopía de dos fotones (TPM) permite a la imagen de fondo en el timo y documentar los eventos que son importantes para el desarrollo de los timocitos. Para seguir la migración de personas entre una multitud de timocitos, generamos quimeras neonatal, donde se obtienen menos de uno por ciento de los timocitos de un donante que es transgénico para una proteína fluorescente doquier expresar. Para generar estas quimeras hematopoyéticas parcial, los beneficiarios neonatal son inyectados con médula ósea de 3-7 días de edad. Después de 4-6 semanas, el ratón es sacrificado y el timo se seccionó en forma cuidadosa y bissected conservando la arquitectura del tejido que se va a examinar. El timo está pegado a un cubreobjetos en preparación para la ex vivo de imágenes de TPM. Durante la exploración del timo se mantiene en DMEM sin rojo fenol que es perfundido con un 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono y se calienta a 37 ° C. Con este enfoque, podemos estudiar los eventos necesarios para la generación de un repertorio de células T diferentes.
Protocol
Transferencia adoptiva
Inyectar los recién nacidos con 50 100 ul de la médula ósea con una jeringa de insulina 4.2 veces durante los primeros 3-7 días de vida, con un final de donantes-a-host proporción de 1:1. Aspirar a un sitio de la inyección por debajo del esternón y las costillas, pero por encima de los intestinos y el estómago. Inserte la aguja lo suficiente como para penetrar en el peritoneo, cuidado de no perforar la membrana. No es raro que algunos de la médula ósea que se pierde durante la inyección. Usted puede reducir la pérdida al aflojar el control sobre el cachorro a medida que se inyecta con el fin de permitir que la piel se expanda y, a continuación, extraer lentamente la aguja.
La disección del timo
Hacer una incisión a través de la línea media y cortar o rasgar la piel dejando al descubierto la caja torácica. Mantenerse en el esternón y el corte a través del peritoneo y el diafragma. Corte a los lados de la caja torácica para revelar la cavidad torácica. El timo se encuentra en la parte superior del corazón. A fin de preservar la estructura del timo, se aferran a los tejidos circundantes como diseccionar el timo. Enjuague el timo con PBS para evitar que se seque durante la disección. Suavemente se burlan de lejos el exceso de tejido en la superficie de la cápsula del timo y dividir en dos los dos lóbulos.
Preparación de tejidos para imágenes
Use adhesivo tisular veterinaria para pegar el timo no a un cubreobjetos cuadrado. Use un pipetteman poner una fracción de un microlitro de adhesivo. Separar el pegamento a la duración aproximada y el ancho de la timo. Constante el timo contra el cubreobjetos y se arrastra en su lugar.
De dos fotones de imágenes
El tejido se sumerge en DMEM sin rojo fenol que es perfundido con un 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono y se calienta a 37 ° C. Excitación de dos fotones se logró mediante una Spectra-Physics Maitai láser sintonizado a 900 nm, y de la PPC, GFP, YFP y Texas luz roja de emisión se separan mediante un 495, 515, 560 espejos dicroicos y recolectados a través de detectores de PMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imágenes de dos fotones en el timo que nos permite examinar en la vida, órganos intactos las interacciones y las migraciones que subyacen a los eventos de selección en el timo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Damos las gracias a Matt Pablo y Jimmy Wu para la asistencia técnica.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
